试管婴儿植入前遗传学诊断单细胞PCR的方法

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)简称PCR技术，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于其可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至可检测范围，故成为基因诊断的重要方法。在PCR基础上衍生的一些扩增技术已用于基因突变的诊断。目前单基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技术通过检测单细胞靶基因的数目及结构有无异常加以诊断。

(一)聚合酶链式反应

PCR实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。基本原理是：用一对寡核苷酸链做引物，引导DNA聚合酶在引物识别位点之间两条互补链上进行DNA合成，经过模板变性、退火及延伸三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，多次循环可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至2×l0(6一7)拷贝。

单细胞PCR无需抽提DNA，经过变性前处理步骤后，即进行PCR循环反应。与经典PCR相比，其优点是无需制备DNA，节省时间，从获得样本、PCR反应到出结果只需几个小时左右。但由于单细胞PCR的模板量极低，仅1–2拷贝，故PCR体系必须具备下列条件：①对模板扩增的忠实性好；②方法稳定；③无非特异性扩增；④扩增的灵敏度高。目前用于PGD的PCR方法主要有以下几种：

1．巢式PCR 由于单细胞中可检测的仅l一2个拷贝的基因序列。为了既不影响特异性又获得较大的敏感性，巢式引物被应用。巢式PCR设置二步PCR，只有初级PCR中特异的扩增片段才可能被二级引物扩增，可减少引物与模板非特异性位点的复性、引物二聚体的形成以及非特异背景产物的产生，从而提高了扩增特异性，而且增加了最终产物量。

2．多重PCR 如果与疾病相关的基因十分庞大，如杜氏肌营养不良症(DMD)，有2 OOO多kb长。这些基因常多处发生缺失或突变，而且这些改变发生在相邻十至数百个kb的距离，超出了PCR技术所能扩增的有效长度，对此，可采用多重PCR，既在同一试管中加人多对引物，扩增同一模板的几个区域。目前报道多重PCR反应最多可同时扩增12条区带。

3．荧光PCR 指荧光标记的寡核苷酸引物。PCR产物用激光分析系统进行分析，从产物大小到核苷酸序列都能够被准确分析。由于不同的荧光分子在激光激发下有不同波长，在片段分析结构系统中，相同大小的不同产物可以被区分开。其敏感性优于普通PCR千倍。准确性可达l一2bp。对于单细胞35–4O个循环就可以产生足够量的产物，不仅减少了散在的、非特异的污染，而且缩短诊断时间。现该方法已广泛用于PGD。

4．荧光定量PCR 该技术融汇了PCR和DNA探针杂交技术的优点，反应体系中，不仅有两条普通的引物，还有一条荧光标记探针。这条探针的5’和3’端分别标记了荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。当探针保持完整时，无荧光发出。PCR开始后，随着链的延伸，Taq酶将荧光探针切断，释放出荧光信号，且信号的强弱与PCR的产物数量成正比，检测出前者可计算出后者，从而获取DNA模板的准确结果。该技术在完全闭管的情况下进行，无需凝胶电泳，通过特殊探头直接探测PCR过程中荧光信号的变化，解决了常规PCR不能定量及扩增产物污染而导致的假阳性、操作复杂等问题，减少污染的可能性，提高了诊断的效率。