试管婴儿植入前遗传学诊断单细胞PCR的方法

5．原位PCR 此技术由HaSSe等于1990年建立，即在固定于同一载玻片上的同一个单细胞上，先用PCR原位扩增，再用FISt{检测，目前PGD中应用该方法，PCR的有效率为65％，FISI–I达85％。遗憾的是ADO较常规PCR高。但这种新方法有效的把原位杂交技术的细胞定位能力与PCR扩增的所有潜在敏感性结合起来，相信随着引物设计及荧光PCR与原位PCR有效的结合，其不足会得到克服，该方法也许会成为PGD的未来。

6．免疫PCR 是PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)法的融合技术，利用了PCR的大量扩增能力和抗原抗体反应的特异性。其原理是将目的基因的扩增产物用生物素标记，检测突变的特异性探针用地高辛标记，二者经变性退火处理后加到含抗生物素的酶标板内，通过显色来鉴定突变是否存在。根据显色深浅可做定量分析。该法已用于囊性纤维病基因突变的检测。

7．等位基因特异性扩增 在设计引物时，根据已知突变位点的特征，在引物3’端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补，而只扩增相对应的突变型或野生型基因。主要用于点突变导致的遗传病的检测。其优点是只需一步PCR，而无需电泳和标记，摆脱了分子生物学方法中必经电泳的现象。在相互竞争的突变型和野生型引物中，分别采用不同荧光染料标记扩增的DNA，可直接对扩增产物进行判读。另外使用具有特定酶切位点的内嵌引物，也可提高产物特异性和产量，DNA扩增后用酶切割，由酶切产物可明确是否有基因突变，该法已应用于单个精子的DNA分析。

8．全基因组扩增技术 PGD的难点之一是可检测的材料极为有限，通常仅l一2个卵裂球细胞，约15–30pg的基因组DNA，很难进行一个基因的多种突变或多位点基因的改变的基因分析。全基因组扩增技术建立和成熟对PGD的开展具有重要的意义。主要有引物延伸前扩增和简并寡核苷酸引物PCR两种方法。它能够无选择偏移的扩增全部DNA序列，从理论上讲，任何基因都能从全基因组扩增产物中检测出，可用于多个突变位点的单基因病、多基因病的诊断及染色体组分析等。

9．微卫星DNA的PCR 多基因遗传病和先天畸形，目前其易感基因研究常用的遗传标记是微卫星标记。微卫星DNA(miCrosatcllite DNA)又称简单重复序列(Sim–pierepcned scquence，SRS)，能参与遗传物质的结构改变、基因调控，是基因重组和基因变异之源。脆性X染色体综合征、强直性肌营养不良、脊髓小脑共济失调等遗传性疾病都与之有关。该方法已用于脆性X染色体的PGD。此外，微卫星DNA多态性的特点可以用来分析单细胞DNA扩增产物的来源及纯度。通过检测进行PGD的双亲的STR等位基因的大小，估计合子的类型。任何可能性之外的基因型都提示存在污染，包括来自母体细胞的污染。这种方法同样也可以发现单体型及同一来源的二倍体。对反复发生的葡萄胎有诊断价价值．

lO．RT–PCR 单基因疾病植入前诊断误诊的原因很大程度上是由于仅有单个DNA拷贝导致扩增失败或污染以及等位基因脱扣。RNA分析如果已知某种与遗传病有关的基因在体外培养期间确实已开始表达，那么将致病基因表达的mRNA反转录成cDNA，对cDNA进行扩增，来检测目的基因，所需的底物拷贝数相对较多，有可能解决单个DNA拷贝对植入前诊断发展的限制。目前已将该法应用于Marfan氏综合征患者的PGD。

(二)单细胞经上述PCR后主要有以下几种方法进行基因诊断