PCR在现代医学检验中的应用

王耿新 刘德亮 王志群 陈献业

山东省青岛市肿瘤医院 青岛 266042

聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction, PCR ）又称体外基因扩增技术或 DNA 扩增技术。自 1985 年美国 PE-Cetus 公司的 K.B Mullis 等人首创了 PCR 技术之后，它以相当惊人的速度被广泛地应用于医学及分子生物学等各个领域。现今， PCR 技术已成为一种对标本中特定的 DNA 片段进行分析研究和检测鉴定的重要方法。近 20 年来 PCR 技术在生物医学等各个研究领域和临床应用中发挥了重大的作用，在病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及治疗等方面都作出了相应的贡献。

1. PCR 技术的基本原理与特点 [1-2]

PCR 技术的基本原理是模仿 DNA 体内复制的机制，在体外进行扩增特异的 DNA 片段。它主要是由三个基本步骤组成的循环反应。首先是变性，用加热的方法使双链 DNA 解链成两股单链；其次是复性，用降温的办法使这两股单链按碱基互补的原则分别与加入的两条人工合成的寡聚核苷酸链（引物）结合成双链；最后是延伸，在合适的缓冲液、镁离子及脱氧核苷酸存在的条件下，用 DNA 聚合酶进行催化，按碱基配对的原则合成互补链。引物从 3 '端进行延伸，合成的方向为 5 '端（一条人工合成的引物）至 3 '端，从而合成与模板 DNA 结构相同的片段。重复上述三步骤，变性→复性→引物延伸的过程，经过约 30 个周期的循环（每三个步骤为一周期，约需 2-3 分钟）， 1-2 小时就能将所需基因扩增几百万倍，使极微量的所需 DNA 达到极易检测的水平。其扩增效率公式为： Y= （ 1 X ） n ，式中 Y 为扩增数目， X 为放大效率， n 为循环次数。

PCR 技术具有敏感性高、特异性强、操作简便、快速省时等特点。其灵敏度可达到 Pg 级，甚至达到 fg 级 [3] 水平，而被扩增的基因片段能与原基因片段保持不变。 PCR 技术操作简便、快速而易掌握，并且对标本要求不高。用过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动 DNA 扩增仪，整个 PCR 过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，用极微量的粗制标本就可获取目的产物。

2. 常用的几种 PCR 及主要用途 [4-5]

2.1 定量 PCR ：用于 mRNA 定量及转录水平的研究。

2.2 抗原捕获 PCR （ AC-PCR ）：用于病毒感染的检测。

2.3 不对称 PCR （ Asymmetric PCR ）：用于制备探针或测序。

2.4 彩色 PCR （ CCA-PCR ）“用于检测某些多型别病毒的混合感染。

2.5 原位逆转录 PCR （ In Situ RT-PCR ）：定位检测细胞中 RNA 病毒感染。

2.6 逆转录 PCR （ RT-PCR ）：用于克隆 cDNA 、检测 RNA 病毒、 cDNA 探针。

2.7 反向 PCR （ inverted PCR ）：用于扩增已知基因片段两侧的未知序列。

2.8 膜 PCR （ membrane-bound PCR ）：可去除污染的杂质或 PCR 产物残留，检测低丰度靶 DNA 。

2.9 间接原位 PCR （ Indirect In Situ PCR ）：定位检测细胞中 DNA 病毒感染，是目前应用较广泛的一种原位 PCR 技术，其特异性比直接 PCR 强。

3. PCR 技术在医学检验中的地位

现代医学研究证明，人类疾病多数是直接或间接与基因有关 [6] ，如肿瘤、糖尿病和心血管疾病等。在医学实验诊断中我们经历了生化和免疫诊断的发展过程，由于各类扩增技术的出现使我们进入了基因诊断的新时代并成就了现代意义基因诊断的崛起。这将改变以往对疾病的表型认识和表型诊断，从本质上认识疾病和诊断疾病。在各类扩增技术中， PCR 的地位尤为突出。目前，全世界利用 PCR 技术诊断感染性疾病每年达几千万人次，其费用早已大幅下降，说明 PCR 有着巨大的潜在市场。美国临床检验标准化委员会于 1995 年颁布了关于感染性疾病分子诊断应用范围、条件和质量控制细则等准则文件 [7] 。而国际临床化学学会于 1998 年又发布了关于分子扩增在临床诊断中应用的质量评估基础的文件并对 PCR 操作的各个环节进行了详细论述 [8] 。由此可见，两个权威性文件也都肯定了 PCR 技术在医学检验方面的重要性。基因诊断可能将是以后的发展方向并作为疾病的常规诊断技术。

4. PCR 技术在医学检验中的应用

4.1 PCR 技术在肿瘤方面的应用

目前，肿瘤发病的分子机制尚不完全清楚。研究表明，人类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系。 PCR 技术的肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。

据有关资料表明 [1 ， 4] 前列腺癌、结肠癌和 Kaposi 肉瘤等与人巨细胞病毒（ CMV ）有关；鼻咽癌和 Burkitt 淋巴瘤与 EB 病毒有关；原发性肝癌与乙型肝炎病毒（ HBV ）有关；泌尿道肿瘤和食道肿瘤等与人乳头瘤病毒（ HPV ）有关。人类肿瘤病毒病因中较为重要的一类病毒是 HPV ，其中大部分只与良性增生有关，只有 16 、 18 、 31 、 35 、 39 等十余型与恶性肿瘤关系密切。 PCR 在检测 HPV ，尤其是第 16 、 18 型有无感染，对子宫颈癌的早期诊断及预防有着显著的意义。

目前，已知肿瘤相关基因有上百多种，但较常见的是 ras 家族的 H-ras 、 K-ras 和 N-ras 三种癌基因。它们的结构相似，其表达产物是 P21 蛋白。在不同肿瘤中 ras 家族癌基因的 H-ras 、 K-ras 点突变多集中在第 12 和 61 号密码子上，而 N-ras 在第 13 号密码子上多发生突变。 PCR 在癌基因的研究方面主要是 ras 基因与肿瘤的关系。现已查明与 ras 基因突变有关 [1 ， 2 ， 4 ， 9 ， 10] 的肿瘤有几十种。如：各种急性慢性白血病、精原细胞癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、结肠癌、子宫瘤等。 Rb 基因 [11] 是人类最早（ 1986 年）发现的抑癌基因，其后又相继发现了 P53 、 WT1 、 NF1 、 DCC 、 MCC 、 APC 、 P16 和 P21 等抑癌基因。在遗传性视网膜母细胞瘤研究中发现位于 13 号染色体上 Rb 基因的缺失与癌变有关。在许多常见肿瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤中，常发现该基因失活 [11] 。在对 P53 基因的研究中 [12-14] 发现该基因的突变和缺失是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤主要有子宫颈癌、肝癌、成骨肉瘤等。遗传学改变主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因发生突变、缺失、增加和易位等而导致了细胞癌变。 PCR 不但能有效地检测基因的突变、重排、易位等，而且能准确检测癌基因表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、鉴别、分型、分期、治疗及预后评估等。