PCR技术：样品处理与注意事项

　　一、样品处理

　　DNA是染色体的主要组成部分，是PCR的扩增模板。要进行PCR，研究DNA结构与功能或者用于诊断目的，首先必须从生物体内提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色体DNA平均大小为3.0×10⁹bp），提取DNA应尽量保持DNA完整性和纯度，即在提取中尽量避免机械张力引起的DNA分子降解，又要注意杂质及蛋白的去除，防止胞内酶解DNA。因此，提取DNA的基本过程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解细胞，消化蛋白质，使核蛋白解聚及胞内DNA酶失活，然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白质，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，最后用乙醇沉淀得到DNA。

　　理论上PCR对模板DNA纯度及完整性要求并不高，细胞经过热变性使DNA释出就可以作为模板，依赖引物的选择性进行扩增。这对拷贝数很多的基因组，确实如此。但当待扩增的拷贝数甚少而无关细胞甚多时则扩增就不易成功，其原因是：①非希望的扩增增多，掩盖了所需扩增的片段，使其数量减少至不能检测到的程度。②生物样品中的杂质会抑制PCR反应，最主要的是血液和琼脂糖。例如在100μl反应液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血红素也会引起明显的抑制。对于含血液的样品，可以用渗透压溶解红细胞，离心集取细胞核，洗除血红蛋白，再用蛋白酶/表面活性剂处理的方法来解决。另一简单的方法是煮沸之，使释放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。

　　现将PCR前处理各种标本的基本方法介绍如下：

　　1．所需溶液

　　（1）PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na₃PO₄ pH7.0

　　（2）含表面活性剂及蛋白酶K的PCR缓冲液

　　50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl₂

　　0.1mg/ml明胶，0.45%NP40,0.45%吐温20

　　高压灭菌，冷冻储存。临用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K（水溶液）至100μl溶液中。

　　（3）溶血缓冲液

　　0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5

　　5mmol/L MgCl₂,1% Triton X-100

　　2．提取方法

　　（1）用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法从血液或培养细胞分离的单核细胞（当PBC〈10%细胞数时用此程序）

　　①将细胞样品用PBS稀释至10ml，置15ml锥形离心管中；

　　②100×g离心2～5min，吸去上清；

　　③细胞再悬浮于10ml PBS中重新离心洗涤；　

　　④沉淀物悬浮于溶液2