转基因烟草的PCR检测
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转基因烟草的PCR检测

点击：   作者：   来源：  时间： 2007-03-07 　本站论坛
一 、材料、试剂和仪器

1 材料 基因特异引物，转基因烟草和野生型烟草的基因组DNA，含目的基因得质粒
2 试剂 PCR Kit
3 仪器 PCR仪（PE2400），电泳仪，紫外照相装置

二、 操作程序

1. 在灭菌1.5mL管中25μl灭菌ddH2O,，加入100ng-1μg转基因烟草和野生型烟草的基因组DNA中，沸水浴5-10min。取出立即置于冰上，使基因组DNA变性充分。


2．在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为25 ul)：
10×buffer 2.5μl
4×dNTPs （每种2.5mM ） 2.0μl
primer I (10pmol/μl) 0.5μl
primer II(10pmol/μl) 0.5μl
Template 19μl
Taq E 0.5μl (2U)
把加样品的EP管稍离心后，置冰上备用，待 PCR仪温度升至94℃时，将管子插入，按Pause键暂停，加入Taq E 0.5μl (2U)[此为热启动Hot start,可以防止非特异性扩增 ]。其上机的循环条件为：94℃变性3min ，55℃退火30sec ,72℃延伸45sec ，共进行30个循环，然后72℃再延伸7min 以补平DNA末端。
3. 1%Agarose gel电泳检测，紫外照相。
三、结果与分析
PCR产物经电泳检测在预计的分子量处出现单一DNA条带，但常常是一条带有主带的弥散带，这在以核基因组DNA做模板是常会出现，可能的原因是：核基因组复杂度高，退火温度低，延伸时间长，引物和模板量大等。解决的方法有：采用热启动（如本实验），减少模板和引物量，提高退火温度甚至在68℃下退火和延伸，降低退火和延伸时间，减少循环次数，改变Mg 2 浓度（1.5-8mmol/L）等。

其中M: DL2000； ( )含目的基因得质粒为模板，作为阳性对照；(-) 为野生型烟草基因组DNA模板作阴性对照；1-5：为转基因烟草基因组DNA为模板。结果表明3非转基因烟草，而1，2，4，5为阳性转基因烟草。特异引物扩增条带长为750bp。

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