PCR产物的克隆

PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。
一、PCR产物的TA克隆 1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。
2.操作步骤
⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
⑵ 10μl体积反应体系如下：
　①取T载体1μl (50ng)，加入等摩尔数PCR产物 。
②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补足至10μl 。
⑶ 稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。
⑷ 转染，蓝白斑筛选同前。
二、注意事项
1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。
2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。
3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。

放射性同位素标记的DNA序列测定分析
测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。
一、 试剂准备
１． 硅化液：四氯化碳 250ml，二氯二甲基硅烷 25ml。
２． 6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵（25%）50μl，TEMED 50μl，轻摇混匀，立即灌胶。
3.质粒DNA碱变性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），无水乙醇，70%乙醇。
4.T7测序试剂盒。
二、操作步骤
1. 测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。
2. 灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。夹好，将测序板放水平。聚合约3hr后预电泳。
3. 预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。设置温度50℃，功率100W，时间约30min。（同时准备测序反应）

4. 质粒DNA双链碱变性：DNA 3-5μg溶于32μl ddH2O中，加2N NaOH 8μl，混匀，室温静置15min。加3M NaAc 7μl，无水乙醇120μl，混匀，-20℃放置30min。离心12000g× 15min，弃上清，70%乙醇500μl洗一次，离心12000g×7min。弃上清，晾干沉淀，10μl灭菌ddH2O溶解。
5. 模板与引物复性：加2μl测序引物、2μl Annealing buffer， 混匀，稍稍离心，65℃温育 5min，立即放置于37℃10min，室温5min以上。
6. 标记反应：加 3μl labeling mixture 、1μl相应放射性同位素（10μCi）、2μl T7测序酶（使用前以稀释液1∶5稀释），混匀，离心，置37℃5min。
7. 预先准备四个0.5ml微量离心管，标上A、C、G、T，分别在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。
8. 链终止反应：在A、C、G、T四个微量离心管中分别加入反应液4.5μl，37℃ 5min。加入stop solution 5μl，短暂离心。
9. 上样：关上预电泳电源，冲洗胶平面，将鲨鱼齿插入胶平面中约1-2mm形成加样孔。将四个反应管置80℃ 2min。立即取1.5-2μl加到加样孔上。
10．电泳: 50℃，100W，电泳2.5hr后，暂停电泳，在预留孔二次上样后，继续电泳2.5hr。
11．下胶：停止电泳，取下测序板，倒掉电泳缓冲液。拆开测序板，凝胶应粘在未硅化的的玻璃板上。裁一张比胶稍大一些的滤纸，平铺在胶上，掀起滤纸，凝胶就被一起掀起。
12．压片：将凝胶盖上保鲜膜，用monitor测读放射强度，以估计曝光时 间。在暗室中覆上X光片，置暗夹中，-70℃放射自显影。
13．洗片、读片：取出暗夹，回到室温。经D72显影、酸性定影液定影，水洗, 晾干。在X光片灯上读出序列。
三、注意事项
1. 测序板清洗、硅化的好坏直接影响灌胶及下胶。处理不好时容易导致灌胶时气泡的产生，下胶时则易使电泳胶损坏。
2. 灌胶时要避免胶的渗漏；注射器将凝胶灌到两块玻璃之间时，注意速度的控制，防止气泡的产生。
3. 测序反应及电泳上样时要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同时要加强整个后续实验过程中自身的防护。