⑶ 扩增产物的处理：将 PCR扩增产物与变性上样液按1：5的比例加入0.5ml 微量离心管中，混匀。样品上胶前应98 o C变性10min，立即冰浴骤冷。取约3～5μl变性样品（根据点样孔的大小决定上样量），以微量加样器上样，（上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散）。
⑷ 电泳：电泳槽接上电极（上槽接负极，下槽接正极）开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。
⑸ 剥胶：电泳结束后，倒弃电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。剪一张与玻璃同样大小的滤纸，严密覆盖于凝胶上，顺一个方向将凝胶缓慢取下，用保鲜膜盖于胶面并包好，避免膜和胶之间产生气泡或皱折，将凝胶固定在X线片夹中。
⑹放射自显影：在暗室中将X线片贴于胶面，盖严片夹，用黑布将X线片夹包裹，置-70OC放射自显影。曝光时间根据同位素的强度而定，约 24h～10d。
⑺ 冲洗胶片从-70oC取出X线片夹，在暗室内迅速取出X线片，立即显影，以免使X线片上出现过多的冷凝水。（如果想再得到一张放射自显影影像，可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温，并擦去冷凝水后再装入新的X线片）。依次按以下程序操作进行显影：
X线片显影液显影 1-5min
水洗 lmin
定影液定影 5min
流动水冲洗 15min
所有使用液的温度应为18～20OC为宜。
三、注意事项
⒈ 核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于<200bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500bp的片段，则仅能检出10％～3O％的变异，因此，<300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。
⒉ 游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。
⒊ 低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用2～3种条件做SSCP，可能提高敏感性。
⒋ 电泳温度: 一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。
⒌ 凝胶的长度: 可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。
⒍ 凝胶浓度及厚度: 凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。
⒎ 假阴性: 一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。
8. 结果分析: 单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。
细胞凋亡的分子生物学检测方法
细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ² 和Mg² 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
一、过氧化物酶标记测定法
原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
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