PCR-SSCP[PCR-single strand conformation polymorphism]

PCR 是 DNA 的聚合酶链式反应 ,SSCP 是单链构象多态性。 SSCP 一般都要采用 PCR 扩增的方法进行检测 , 故名 PCR-SSCP 。此项技术的原理是 , 不同序列组成的单链 DNA 或 RNA 在非变性聚丙烯散胶凝胶中电泳 , 会因其空间构象不同表现出不同的迁移率。因此 , 可以将基因组中特定的 DNA 片段用 PCR 方法扩增 , 然后变性成为单链 , 在非变性聚丙烯酷胶凝胶中进行电泳 , 与对照的 DNA 片段进行比较 , 只要它们之间存在一个碱基的变异 , 就会表现出电泳行为的不同。显示不同 PCR 扩增片段电泳迁移率的方法 , 可采用漠化乙键染色或银染色 , 或用放射性同位素或荧光素标记在 PCR 引物上 , 然后进行检查 , 可提高分辨率。 PCR-SSCP 分析技术在检测与疾病有关的单个碱基突变、连锁分析等方面极其有用。

　　在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

　　(1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

　　按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TBE封闭，备用.

　　(2)电泳

　　取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.

　　(3)银染法

　　将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.