| PCR过程完成之后，对采集到的数据进行离线分析，样品的起始拷贝数可以通过样品与标准曲线的比对来定量，这一过程全部由软件自动实现，同时可将分析结果进行保存或打印。
4.2 数据分析软件设计
扩增产物进行连续的实时荧光信号检测，可以帮助用户精确计算样品中的初始模板量。在指数扩增期，反应中的初始模板量与在荧光信号显著增加之前的循环数之间的重复性非常好。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念:Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出图4所示的标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图4 由最大二阶导数法分析所得的曲线
软件设计主要采用Lab Windows/CVI作为开发环境，并借助CVI的图形化界面和面向对象的程序设计方法，可以简单、准确的完成数据采集与分析软件的开发。在此，所设计的数据分析软件流程如图5所示。通常，确定Ct值的方法可决定样品的分析模式，在定量分析时有两种方法可供选择：最大二阶导数法和曲线拟合法。
⑴最大二阶导数法。在分析过程中不需要用户进行任何设置，自动确定荧光曲线的第一个最大二阶导数点，由软件计算出Ct值并画出标准曲线，从而可得到样品的起始拷贝数。
在这种方法使用时，用户只需要选择适当的标准样品来确定标准曲线，适合快速自动的分析。不过在样品浓度起始拷贝数比较少的情况下，其结果的误差较大。
⑵曲线拟合法。在分析的过程中，需要用户根据实际情况进行适当的调整，通过基线调整和噪声带设置来选择适当的荧光采样点，使标准样品产生的误差对结果的影响最小化。
在采用最大二阶导数法时，要得到有效的标准曲线需要最少4组标准样品，并且标准样品的起始拷贝数不能过低。而曲线拟合法可以有效的克服这些问题，使用户能得到理想的Ct值和标准曲线。另外曲线拟合法也可以消除由于承载各个样品的试管不同而引起的误差。
5 结束语
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环中均能检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。该技术广泛用于基因表达研究、转基因研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
参考文献：
[1] 丁振若等主编. 临床PCR基因诊断技术,世界图书出版社西安公司，1998.9
[2] 杨安钢等. 生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社2001.1
[3] 张凤均等编著.
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