| PCR产物克隆 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-27 本站论坛 |
|  |
DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合适限制酶切点而受限，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选困难。采用PCR技术行DNA和cDNA的克隆，则可大大缩短克隆时间，比之全基因合成更为经济和方便，因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染性疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题，采用产物克隆和测序方法，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的克隆方法也将不断出现。
常见问题分析：
1. 克隆PCR产物的最优条件是什么？
参考见解：最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8至8：1也行。应测定比值范围。连接用5μl 2X缓冲液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10μl。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
2. PCR产物是否需要用凝胶纯化？
参考见解：如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是非特异性扩增后者引物的二聚体。即使少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3. 转化结果失败，还需要作什么对照实验？
参考见解：
1、 涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
2、 转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1μg/ul质粒1:100稀释,1μl用于100μl感受态细胞转化。用SOC稀释到1000μl后，用100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000μ后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ μg转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ μg感受态细胞如没有菌落或少有菌落，应是连接的问题。
3、 如用pGEM-T阳性对照（positive control），或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
4、 用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接阳性对照插入片段，转化高效率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4. 对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
参考见解：
1、 连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
2、 插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T阳性对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
3、 插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
4、 带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加入Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
5、 高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。
上一篇：PCR扩增产物的分析 下一篇：污染分析及对策 共2页: 上一页 [1] 2 下一页 | | |
|
|
|
