| PCR定点突变应用实例 | | 点击： 作者： 来源：基因酷 时间： 2007-10-27 本站论坛 |
|  | 1、 PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体，并比较研究FALL-39及其突变肽的功能：方法：应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT为载体，构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术，用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天门冬氨酸，构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽；对纯化产物进行的：MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1：iNOS的表达，研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正确；DNA测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质粒pGEX-λT-FALL-39-Lys32，用两步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lvs24以及pGEX-λT-FALL-39-Lys24’32；重组原核表达质粒pGEX-λT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达，经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39，FALL-39-Lys24，FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24’32(约4Kd)：突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)值FALL-39-Lys24’32最小，其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24，均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39两种蛋白均在含：Medium E的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后FALL-39-Lys32蛋白对LPS引起的iNOS mRNA的表达量增强抑制作用明显。结论：用FALL-39基因大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白；用高保真的Polybest DNA多聚酶进行一步法PCR定点突变技术简单、有效；突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加，较大剂量时略有增加，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。――引自：《用PCR定点突变方法研究人抗菌肽FALL-39功能与结构的关系》，作者：杨云霞。
2、 基因改造中快速PCR定点突变方法应用：铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因为可以消除O-? ·2而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症，但是由于多种因素影响，尤其是Cu，Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。定点突变技术是改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等。但由于这些方法操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到一定限制。本研究采用一种近年来新的定点突变技术—快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD进行了基因改良(将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子，以提高其稳定性)，同时对该定点突变技术要点进行探讨。
1) 材料
菌株与质粒?? E.coli DH5α，由本实验室保存。质粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约33kb)由本实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。
主要试剂?? Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNA Marker,T4DNA连接酶，Eco RI等常规酶(上海Sangon公司)。
pESOD质粒提取及鉴定?? 用质粒快速抽提纯化试剂盒从含pESOD质粒的E.coli DH5α转化菌里提取pESOD质粒，取部分质粒用EcoRI酶切后琼脂糖电泳鉴定，另取部分质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。
2) 定点突变
引物设计?? 根据hCu，Zn-SOD基因序列和定点突变的要求(将hCu，Zn-SOD中第111位Cys的密码子TGC突变为Ala密码子GCC)设计出一对包含突变位点的引物(正、反向)P1和P2,具体序列如下：P1：5′CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3′；P2：5′GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3′。下划线的碱基为突变位置。所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。
PCR定点突变?? 整个反应体系为50μl，其中含无菌去离子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
转化?? 用Dpn I限制性内切酶处理PCR反应产物，直接转化感受态的E.coli DH5α，涂布培养后随机挑3个菌落并提取相应质粒，由上海博亚生物技术育限公司测序，测序引物P3：5′ACTCAGGTACTGGGAGTG 3′。
通过快速PCR定点突变，本研究实现了把hCu,Zn-SOD基因中的Cys111突变为Ala111。整个突变过程只需要1次PCR反应、1次DpnI酶解和1次转化，即完成了定点突变，无需对PCR产物进行末端处理，也无需进行亚克隆等，大大减少了传统定点突变的工作量，而突变成功率较高(本次实验随机挑取的3个菌落中有2个是阳性突变菌落)，尤其适用于大肠埃希菌来源的DNA。
快速PCR定点突变的技术要点：(1)准备突变的质粒必须是甲基化。(2)引物是一对包含突变位点的互补的(正、反向)核苷酸链，而且要比一般的PCR引物(18bp～21bp)长，一般要在25bp以上，因为引物中含有突变位点，和模板不能完全匹配。(3)须要高保真的DNA聚合酶如Pfu Turbo聚合酶。(4)PCR产物要用DpnI酶充分酶切消化，以提高突变检出率。(5)PCR延伸步骤时间要充足；因为Pfu DNA聚合酶扩增速率为05kb／min，比Taq酶慢1倍左右。(6)高保真Pfu DNA聚合酶酶量要比普通PCR所需的Taq酶多一些；因Pfu DNA聚合酶不但扩增速率较慢，而且一步法PCR定点突变扩增的是整个质粒，故所需的总时间比一般的PCR时间要长很多，适当增加酶量以补充长时间高温下的酶活力损失。(7)克隆子最后需经测序验证；高保真不等于100％保真。本研究挑选测序的3个菌落中有1个是未突变的阴性菌落，故后续的测序步骤不能省略。――引自：周赞虎，张永祥，陈枝华，刘仁海，田蕴，郑天凌 2007-4-18 9:32:56 《中国公共卫生》 2007 年 1 月 第 22 卷 第 1 期
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