PCR的各种应用模式

1. 兼并引物（degenerate primer）PCR
密码子具有兼并性,单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷（deoxyinosine；di）引物进行PCR，可以代替编码蛋白的多种兼并密码子中的兼并碱基，di的特异性主要受cDNA浓度影响。
2. 套式引物（nested primer）PCR
用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或centricon30(amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞as52的分子突变。as52细胞含有单拷贝的细胞gpt（guanine phos－phribosy transferase）基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。
若将套式PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（至25～30bp），同进缩短内引物长度（15～17bp），使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入，两种循环一气呵成，等于只做一次PCR，而灵敏度与套式二次PCR无异。套式一次PCR的成功，使PCR检测的全过程可以在5h内完成，使当天出检验报告成为现实，也使PCR检测走入临床有了现实的基础。
3. 反向PCR（inversePCR或reverse PCR）
反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（yac）大的线状DNA段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA段序列的识别十分重要。
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在yac或cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。
4. 不对称PCR（asymmetricPCR）
所谓不对称PCR就是加入的两条引物的量是不同的, 这样进行PCR其结果就是产生了很多单链DNA,这是与普通PCR 的最重要区别了. 这样做的目的是为了制备探针.这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定.
不对称PCR（Asymmetric PCR）的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50～1：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA（ds-DNA），再以ds-DNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。
　　产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。
不对称PCR主要为测序制备ss-DNA，尤为用cD－NA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。
5. 加端PCR
加端PCR（add-pcr）是使扩增产物的5’-末端加一段DNA顺序的PCR。设计加端PCR的引物时，除与模板配对的那一部分外再加上若干碱基，这样使扩增产物的末端加上额外一段DNA，如加上一个限制酶的识别顺序或特定功能的DNA段。stoflet等报道在结构基因前加上噬菌体t7的启动子，当然也可用于DNA段的末端标记或引入特定的点突变。末端可加碱基的数量与引物的长短有关，当引物足够长时扩增产物或末端甚至可以加上十几个到几十个碱基。
6. 锚定PCR或固定PCR
锚定PCR特别适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，对于一端序列已知、一端序列未知的DNA段，可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。loh等用a-PCR对人外周血淋巴细胞t细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA，并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个polyg尾巴。loh等恒定区与可变区连接部位设一个引物，另一个引物是一个具5’-polyg尾巴的引物。带有polyg尾巴的引物是一个固定点，它可以并与polyg尾巴结合，无论其余部分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明a-PCR不对任何特殊序列有倾向性结果，可用于t细胞、肿瘤及其它部位抗体基因的研究。

7. 玻片PCR
在聚丙烯管中可以对多种含膜板材料进行PCR，而在显微玻片上用组织细胞涂片或切片直接进行DNA扩增的方法就称为玻片PCR（slide-PCR）。