| PCR的各种应用模式 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-27 本站论坛 |
|  |
先将细胞涂片或呈单层细胞，然后用甲醇/醋酸（3：1，v/v）、carnoy溶液、无水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5～15min。用蒸馏水冲洗，干燥，直接使用或保存于-20℃备用。在玻片上划20mm×28mm为免疫组化反应区。加入30μl PCR反应混合液，其中含10mmol/l tris ph8.3,50mmol/l kcl,1.5mmol/l mgcl2,200μmol/l dntps,100nmol/l引物，0.01%（v/v）明胶，0.2% bsa, 2.5u/100μl taq酶。然后盖上22mm×40mm的盖玻片，边缘用石蜡油封好。把玻片放入PCR热循环仪金属块上，使金属块与样品呈最大程度接触，同在聚丙烯管中一样，进行30～40个循环。对于较短的扩增片段在后期循环中变性温度可降低。反应后，将致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蜡油，但不取出盖玻片，用一个尖镊子轻轻拈起盖玻片一角，在相对的一角中PCR反应混合液呈半月形液面，用移液器回收。一般可回收25μl混合液，将反应产物进行琼脂糖电泳或用套式PCR引物按标准PCR进行重新扩增。片上扩增物可做原位杂交显示。
在slide-PCR中，需0.1%～1%的bsa。加入bsa可以保证扩增结果，但效率不一定很高。明胶（至少0.0001%）,对扩增1kb左右的靶DNA十分重要。但对小片段扩增结果影响不大。不同的样品提取方法或固定法对slide-PCR都可行。
silde-PCR的机理可能是在起始变性过程中一部分DNA从细胞中洗提出来，然后在细胞和玻片的水相中进行PCR。用地高辛标记的人全基因组DNA探针杂交表明在起始循环中DNA极微量，而30个循环后很丰富。常规细胞染色表明只有少量的形态改变。
silde-PCR对于玻片上的细胞样品提供了一种较好的方法，而不必再把这些样品从玻片上括下来，使操作简便，污染减少。本方法对于原样品量极微且需病史追踪保存的（如子宫颈涂片或涂片）具有实用价值。
8. 免疫-PCR
免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，尤其适用于极微量抗原的检测.免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应，②与嵌合连接分子结合，③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中，嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.
免疫PCR优点为:①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.②敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测.③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行.
上一篇：PCR技术用于基因突变的检测 下一篇：原位PCR介绍
共2页: 上一页 [1] 2 下一页 | | |
|
|
|
