牛颜冰﹡，郭失迷，申林炎，雷万钧，雷霄飞
（山西农业大学，太谷 030801）
摘 要：RNA 沉默是真核生物的一种高度保守的和序列特异的RNA 降解系统，它不但是基础生物学领域的研究热点，同时在调节基因表达或研究基因功能方面也是非常有前景的。植物中的转录后基因沉默(PTGS)是RNA 沉默的一种形式，通过PTGS 能对目标RNA 进行特异性降解。对双链RNA(dsRNA)在RNA 沉默启动中所起中心作用的认知，形成了几种RNA 沉默载体的构建方法，这些方法与基因组资源相结合，通过转基因或非转基因的方法能够快速和高效研究植物的基因功能。
关键词：RNA 沉默；分析；基因功能
The research on the analysis of gene function in plants mediated by RNA silencing
NIU Yan-Bing*, GUO Shi-Mi, SHEN Lin-Yan, LEI Wan-Jun, LEI Xiao-Fei
(Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)
Abstract: Being a highly conserved and sequence-specific RNA degradation system in eukaryotic, RNA silencing is both a fundamental biological issue and a highly promising application upon the control of gene expression or the analysis of gene function. Posttranscriptional gene silencing (PTGS) in plants is a form of RNA silencing by which target RNA is degraded in a sequence-specific manner. Realizing regarding the central role that double-stranded RNA plays in triggering RNA silencing has prompted the development of several vectors construction for RNA silencing. These methods, in combination with the genomic resources, by means of transgenic and non-transgenic technology, have provided rapid and efficient means by which to investigate gene function in a wide range of plant species.
Key words: RNA silencing ; analysis; gene function
RNA沉默是真核生物的一种高度保守的和序列特异的RNA降解系统，该系统包括植物中的转录后基因沉默(PTGS)、动物中的RNA 干扰(RNAi)和真菌中的消除作用(quelling)[1]。对RNA 沉默的遗传和生化研究发现，不同生物体中存在着几个相同的 RNA 沉默相关基因，如RNA 依赖的RNA 聚合酶 (RdRP)、RNA酶Ⅲ样的核酸酶(Dicer)和PAZ/Piwi区的蛋白(ARGONAUTE)，这暗示着真核生物的RNA 沉默是高度保守的。现在公认的RNA沉默机制是双链RNA(dsRNA)高效启动RNA 沉默后，被Dicer 切割成21~26 nt 的小干扰型RNA(siRNAs)，随后 siRNAs 整合入RNA 诱导的沉默复合物(RISC)，并引导RISC 对与siRNAs 同源的目标RNA 进行降解[2]。鉴于RNA沉默可以以序列特异性的行为抑制基因表达，而植物中以基因为目标的同源重组又相当困难，所以RNA沉默是一种极有前途的研究基因功能的反向遗传学研究工具。
RNA沉默作为反向遗传学研究工具，在分析功能基因上，相对于传统正向遗传学有许多优势，如传统的插入突变导致一个家族的某一成员失活后，家族中的其他成员可弥补其功能，从而造成无法研究其家族成员的功能；传统的基因筛选对一些胚发育期必需的基因的插入突变将导致致死型突变，从而得不到突变表型，而 RNA沉默中的病毒诱导的基因沉默(VIGS)是对成株植物诱导产生表型突变，可以对胚发育期致死基因的功能进行研究。RNA沉默通过同源性起作用，如选取所有家族成员的高度保守区，就能沉默整个家族成员。因此，用RNA 沉默分析功能基因就成了分子生物学领域的研究热点。
1.RNA沉默载体的构建方法
Waterhouse等[3]将马铃薯Y病毒(PVY)的辅助因子蛋白(HC-Pro)基因分别正向或反向转入烟草，对其后代杂交分析发现，含有正向或反向HC-Pro 的转基因植株中，仅有15% 的植株对PVY 具有抗性或免疫作用；而同时含有正向和反向HC-Pro 的转基因植株中，对PVY有免疫作用的植株则占转基因植株总数的44%~54%。于是他们推断在同一植物细胞中同时含有正义和反义RNA(即dsRNA)是诱导烟草植株发生RNA沉默或对PVY产生免疫作用的真正原因。几乎与此同时，F i r e 等[ 4 ]将小杆线虫 (Caenorhabditis elegans)内源mex-3 的dsRNA 注入 C. elegans，导致C. elegans 内源的mex-3 的转录产物大幅度下降，甚至消失，首次证实dsRNA 的确是RNA 沉默的诱导因子。随着对dsRNA 能高效启动RNA 沉默认识的深入，现发展了几种诱导植物 RNA 沉默的载体构建方法。
1.1沉默效率高、强度大的载体的构建 Waterhouse 等[3]发现在强结构型启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体是诱导
RNA沉默的最基本结构。在该载体中，目标基因的c
DNA 片段被
克隆在间隔序列的两端，这些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我互补的hp
RNA (分子内ds
RNA)结构。Wesley 等[5]证实用反义抑制和共抑制等传统方法介导的PTGS 的沉默效率在 0%~30%，平均为12%~13%，而hp
RNA 结构则能显著提高
RNA 沉默的效率和强度。如空间序列是 c
DNA 片段或不能被剪切掉的内含子，其沉默效率在48%~69%，平均为58%，若将有功能的内含子 (转录后能被剪切掉)替代该空间序列则可进一步将沉默的效率提高至66%~100%，平均为90%。事实上，利用hp
RNA结构进行植物抗病毒和沉默内源基因已有许多成功的报道。如牛颜冰等(待发表)将番茄花叶病毒的移动蛋白基因(ToMV-MP)的反向重复结构转化烟草，在所得的47株转基因烟草中就有23 株对ToMV 有免疫作用；将黄瓜花叶病毒的部分复制酶基因(CMV-ΔRep)的反向重复结构转化烟草，在所得的40 株转基因烟草中就有25 株对CMV具有免疫作用。
Kamath 等[6]认为在全基因序列或表达序列标签等的协助下，利用hpRNA 结构诱导RNA 沉默是一种十分有效地研究植物基因功能的手段。但由于必须将两个同源的DNA片段以相反的方向克隆进同一载体才能形成hpRNA 结构，致使构建hpRNA 结构的劳动量很大，加之大的双元载体也限制了克隆 DNA 片段的酶切位点的利用，造成其转化效率低下，故hpRNA 结构不适合大量分析基因的功能。
1.2高产量RNA沉默载体的构建
以重组为基本克隆方法的Gateway 技术不需要限制性酶切和连接的烦琐步骤，在Gateway 双元载体pHELLSGATE中，cDNA片段能以反向重复的方式一步克隆在内含子两端。它克服了hpRNA结构构建的种种缺陷，借助于Gateway 介导的策略，研究者正在构建大约含有25 000 个特定基因标签的高产量的RNA沉默载体。这一资源与接近饱和的插入突变体库的联合应用将能极大地促进基因功能的鉴定。
1.3RNA沉默目标特定性载体的构建
除Gateway 技术外，以RdRP 介导的、siRNA 扩增为基础的、借助于异源3' 端非翻译区的沉默系统（SHUTR），也适用于许多基因的功能分析。在SHUTR 方法中，硝酸还原酶（NOS）的3' 端非翻译区反向重复排列用以产生初级siRNAs，5' 端单链区产生次级siRNAs来决定目标的特定性，这一过程称为转移RNA沉默。在基因功能研究方面，转移RNA沉默的优势是善于寻找几个具有重叠功能的相关成员，不太适合于高度保守的基因家族的某一特定基因的功能研究。事实上，Palatnik 等[7]已用拟南芥JAW的miRNA沉默了多TCP基因的mRNAs。至于目标的特定性，Mette 等[8]认为，相对于转录区而言，某一基因家族高度类似的成员的启动子区没有必要非有保守序列。
1.4特定植物RNA沉默载体的构建
随着研究者试图对特定基因进行深入研究，以组织特异性行为沉默基因表达愿望的加强，RNA沉默载体的构建方法也得到了进一步发展。例如， Guo 等[9]为了控制RNA 沉默起始的时间，利用17β 系统和Cre/loxP 介导的重组系统，构建了适用于必需基因或在植物的不同发育阶段起多重作用基因功能分析的特定的载体系统。最近Roignant 等[10]发现果蝇的某些细胞中没有发生系统性沉默，存在着特定细胞的RNAi。随后Palauqui 等[11]又证实，由于 RNA沉默信号的系统传导特性，植物局部的或限时的RNA 沉默系统还没有变为现实。不过有趣的是，有些病毒蛋白能抑制系统沉默，但不抑制局部沉默。另外，有研究表明控制拟南芥叶片极性的基因 PHV，在体外miR165 的指导下，能被Dicer 切割，认为PHV 能依赖于miR165 RNA发生局部沉默。对 RNA沉默的系统特性和miRNA介导的基因表达的发育控制的阐明，将有助于RNA沉默系统更加复杂化和多样化。
1.5新型的DNA卫星分子——DNA βRNA沉默载体的构建
VIGS研究基因功能的方法是将携带植物功能基因cDNA 的病毒侵染植物，通过诱导植物发生基因沉默而使植物出现表型突变，从而借助于植物表型或生理指标的变化来反映基因的功能。以往多是以 RNA 病毒、DNA 病毒以及极少的卫星病毒载体的 VIGS 体系来研究基因的功能，最近Tao 和Zhou[12] 建立了一种以新型的DNA 卫星分子为载体的VIGS 体系。
他们将中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)伴随的新型
DNA卫星分子(
DNAβ)的βC1基因(βC1基因对于致病是必需的，但对于
DNAβ的复制却并非必需)进行缺失和引入多
克隆位点(multiple cloning sites，MCS)，改造成一种卫星
DNA 载体，将外源片段引入多
克隆位点，利用βC1 的启动子和终止子进行转录和表达。对
DNAβ 载体的测试表明，该载体既可以抑制转基因GFP 的表达，也可以抑制内源基因，如八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)和镁离子螯合酶的关键基因Su(Sulfur)的表达；虽然辅助病毒TYLCCNV 并不侵染分生组织，但是它也同样可以诱导分生组织特异性表达的增殖性细胞核抗原基因(proliferating cell nuclear antigene，PCNA)发生沉默；该卫星
DNA 载体还可以同时抑制两个基因的表达。改造的卫星
DNA沉默载体本身在植物中并不产生任何的症状，因此，在最大程度上减少了对 VIGS 沉默表型的干扰效应。
DNA 卫星载体具有一切卫星分子的特点，从诱导基因沉默的效果和持久性来看，以
DNA卫星分子诱导的基因沉默是一种非常有前景的VIGS 体系。
1.6.RNA沉默载体中引起有效沉默的外源片段的长度
Waterhouse 等[3]认为hpRNA结构中正义和反义臂的长度为98 bp~853 bp 时，能引起植物发生RNA 沉默。Thomas 等[13]发现对于转基因绿色荧光蛋白 (GFP)来说，诱导基因沉默的最小插入片段可小至 23bp，再小的片段就不能诱发RNA 沉默；但对于植物内源功能基因来说，在PVX 载体上插入33 bp 的片段，才可以诱发八氢番茄红素脱氢酶基因 (PDS)发生沉默，并且具有区域与位置效应，同样是33 bp，在基因的中心区可以沉默，在其他区则不能，有些甚至插入52 bp 也不能诱发基因沉默。插入片段的方向对沉默也有影响，对于转基因和内源基因，反向插入比正向插入更容易引起基因沉默。
2.1RNA沉默介导的转基因分析基因功能
沉默效率高、强度大的载体，高产量RNA 沉默载体，RNA沉默目标特定性载体和特定植物RNA 沉默载体均可通过转基因的方法来分析能进行遗传转化植物中的基因的功能，如最近Rohr 等[14]将两个基因融合后构建成反向重复导入植物后同时沉默了两个内源基因，产生了两个基因的突变表型。
2.2RNA沉默介导的非转基因分析基因功能
转基因的方法不适于分析许多不能或很难进行遗传转化的植物，如小麦、大豆等中的基因的功能。而病毒介导的RNA 沉默和瞬时RNA 沉默则能克服RNA 沉默应用的这一局限，拓宽了RNA 沉默分析基因功能的应用范围。
2.2.1病毒介导的RNA沉默分析基因功能
许多植物病毒，如马铃薯X 病毒(PVX)、烟草脆裂病毒 (TRV)和大麦条纹花叶病毒(BSMV)等均已被改造成 VIGS 载体，在建立起寄主和病毒相互作用的条件后，VIGS 有用于包括难于转化的植物中基因功能研究的潜能。然而，有些情况下，植物与病毒的相互作用造成了沉默状态和沉默强度的差异，如植物分生组织中不存在沉默信号[15]、病毒通常含有沉默抑制蛋白等 [16]，这些给VIGS 分析基因的功能带来了困难。不过幸运的是Ratcliff 等[17]发现TRV 载体尽管不使分生组织发病，但却能在植物的分生组织中诱发基因沉默，Tao 和Zhou 等[12]也发现辅助病毒TYLCCNV 虽然不侵染分生组织，但它也同样可以诱导分生组织特异性表达的PCNA 发生沉默。因此，只要选择好合适的病毒(如TRV、DNA 卫星)， VIGS 就可成功应用于基因功能的分析。
2.2.2瞬时RNA 沉默分析基因功能
Azevedo 等[18] 将hpRNA结构在大麦中瞬时表达，研究了来源于病源的抗性。牛颜冰等[19] 也发现，瞬时表达CMVΔRep 病毒和ToMV-mp dsRNA的烟草能阻止相关病毒的侵染。Bezanilla 等[20]则进一步证实，瞬时沉默一般可持续8 天时间，这一时间足以用来观察生态学的发展过程。基于农杆菌或病毒介导的对RNA沉默的瞬时诱导依赖于核苷酸的侵染性，所以丢失功能的表型如果能仅仅发生在单细胞水平上，那么对 RNA沉默的瞬时诱导将不失为一个快速分析基因功能的方法。同时瞬时RNA沉默也可用于难以遗传转化植物(如蕨类)等中的基因功能的研究，具体方法是将含有dsRNA的萌芽培养基与蕨类温育造成蕨类待试基因的胚芽发生RNA 沉默[21]。
由于si
RNAs 决定着RISC 作用目标的特定性，所以直接投递si
RNAs也是一强有力和直接研究基因功能的方法。在哺乳动物体系中，长于3 0 n t 的 ds
RNA将可诱导干扰反应，从而导致哺乳动物全身蛋白合成反应关闭，所以，这一方法倍受青睐。现在已有研究者将报告基因及其相应的si
RNA同时引入烟草BY2，成功地诱导了报告基因的
RNA沉默[22]。
3前景和展望
Szittya 等[23]发现低温可通过抑制烟草和拟南芥 siRNAs的生成来抑制RNA沉默介导的防御反应。尽管RNA沉默的这一低温敏感特性限制了它在低温条件下的应用，然而，它却提出了或许温度是控制 RNA沉默诱导与否开关这一设想，同时也暗示RNA 沉默机制还有待进一步研究。
随着克隆在VIGS或hpRNA结构中基因的收集和近200 种植物表达序列标签(ESTs)在DNA数据库中的贮存，RNA沉默将有可能应用于更多植物功能基因研究中。基于RNA 沉默依赖于细胞生物学反应，故核苷酸序列的转变、点突变不能造成有价值的变异，从这一点来看，RNA 沉默不能完全替代传统的突变方法。在后基因组时代，对模式植物中 RNA沉默机制的深入研究，RNA沉默机制向绝大多数非模式植物延伸都将成为一个大的挑战。从基础生物学和商业的观点，尤其是从植物的进化和多样性方面来看，在分析基因功能方面，RNA 沉默必将显示出巨大的潜力。
[参 考 文 献]
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