【
实验目的】
掌握地衣酚显色法测定
RNA含量的原理和方法
【
实验原理】
RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的戊糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与地衣酚（3,5—二羟基甲苯）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有最大吸收。当
RNA浓度为20μg／m1~250μg／m1时，吸光度与
RNA浓度成正比。
【
实验材料】
1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计。
2.实验试剂
（1）
RNA标准液：称取10mg
RNA(需先定磷确定其纯度)用少量水溶解(若不溶可用2mol／L NaOH溶液调至pH7.0)，定容至100m1，浓度为100µg／ml。
（2）
RNA样品液：用上述实验方法提取的
RNA样品
（3） 地衣酚试剂：取0.1g地衣酚溶于100ml浓盐酸，再加入0.1gFeCl
3·6H
20。该溶液使用前新鲜配制。
【
实验操作】
1．标准曲线的绘制
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。
|
试剂 |
管号 |
|
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
RNA标准溶液，ml |
0.0 |
0.1 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
|
蒸馏水，ml |
1.0 |
0.9 |
0.8 |
0.7 |
0.6 |
0.5 |
|
地衣酚试剂，ml |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
|
A670 |
|
|
|
|
|
|
加样完毕后混匀，于沸水浴中加热20min，取出置自来水中冷却，以零号管为对照，670nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标，
RNA浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。
2．样品测定
取试管3支，两支为样品管，—支为空白管，在样品管中加入1.0m1样品液，再加3.0m1地衣酚试剂，混匀，置沸水浴中加热20min，取出冷却。空白管操作与标准曲线制作中零号管相同。以空白管调零点，于670nm处测吸光度，根据吸光度值从标准曲线上查出相应的
RNA含量。
【
实验结果讨论】
1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，
DNA及其他杂质也有影响。故一般测定
RNA时，可先测定样品中
DNA含量，再算出
RNA含量。
2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。
【
思考】
配制地衣酚试剂时，为什么要加FeCl
3，6H
2O?
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