氯化锂法提取总RNA:
本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA丢失的缺陷。
试验试剂:1、 氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L,过滤灭菌】
2、 悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】
试验步骤:
1、 对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液,匀桨器高速匀桨2分钟;对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中。
2、 匀桨液在0-4℃放置4小时后,12000g离心30分钟。
3、 取沉淀,加入原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液,重复步骤2。
4、 沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后,加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀,4000g离心5分钟。
5、 取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH5.2)及2倍体积的乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心。
6、 70%乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
7、 RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于-70℃保存。
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