黄曲霉rna提取（trizol法），加完异丙醇沉淀后得到的是接近透明的沉淀，加75％酒精洗涤后，加depc水能溶解，电泳后跑不出来带，有的点样孔很亮，是怎么回事？另外，是不是rna即使降解了也能跑出smear带？
参考见解：
1、 可能是菌体量过大导致Trizol量严重不足，一般为100mg/1 ml Trizol。
2、 存在操作过程中蛋白质残留过多的现象是点样口很亮，用氯仿抽提时，尽量不要吸到蛋白层，为保证RNA 的质量，水层可以稍稍多留点；照片说明RNA在 提取过程中降解了，出现了一片Smear。
3、 导致RNA 降解的原因很多，过滤后的菌体用Pbs清洗后是不是用离心的方法收集的菌体。PBS洗涤后有没有把PBS完全吸尽；没吸尽的话可能导致trizol不能完全把菌体中的RNA酶抑制住从而导致RNA被完全降解。
4、 液氮研磨的时间并不重要，最好是快速而充分的研磨才是最必要的，而且中途不能让其解冻。觉得可以了就马上加trizol 一直研磨直至其变得像润肤霜就可以继续下面步骤了重要的是菌体量和 Trizol加的量有多大，如果Trizol加量相对少，就不能很好的裂解组织和细胞，同时也不能很好的保护RNA,RNA会被RNAase降解掉，所以可以适当增加Trizol的量。
5、 再有操作过程是否规范，最好都是用过滤嘴枪头，最好都是经过depc处理tip and tube 使用一次的橡胶手套，全程带口罩等等细节。至于电泳的问题只要是RNA专用的电泳槽， 电泳槽的问题不大，最主要是在提取的过程中RNA降解了。
提肝的RNA,效果很好,但提脑和卵巢却提不出来,都是同期采的样,不知道问题出在那里?
参考见解：
1、 使用组织提取RNA时组织必须新鲜,时间一长RNA便容易被内源性的RNA酶降解,即使把组织放在-80也阻止不了RNA酶的作用.如果用trizol提的话应该趁组织新鲜时先进行匀浆,再把匀浆液放于-80冻存.因为trizol本身含有酚,对RNA有一定的保护作用.
2、 DNA和RNA 的含量都是非常高的,脑卵巢中要少.注意RNase.最后溶解RNA加的DEPC处理水不要太多.在提取的过程中也要注意外源性RNA酶的降解，如果用trizol法的话，一般先降trizol加到研磨器中再加入组织研磨，整个过程中都要带手套，所有材料最好都要用DEPC水浸泡以后再高压.
做有关蚯蚓RNA提取，为什么做了好几次都是只有18S却没有28S？！18S带清晰且没有拖尾，而28S却一点点都看不到，好象没有的样子，用的是TRIZOL方法，是怎么回事呢？
参考见解:可能RNA已经降解了，28S降解会先成为18S，正常的条带28S的亮度是18S的两倍。而且会有5S的条带。
阳性菌RNA提取可否用Trizol?是否可用其他试剂?
参考见解：不可以，阳性菌细胞壁含有交联的肽聚糖，Trizol没有这个能力破碎。可以尝试采用超声波破碎再加Trizol提取的方法（一般是加入Trizol后再超声波破碎），或者是研磨破碎再加Trizol，可以根据实验室的条件都做一下，选择其中效果比较好的方法。
做共同叶片RNA提取。在提取RNA后跑电泳后在点样空和28S间总有一段DNA的亮带。怎么除去ＤＮＡ污染呢？用的是ＱＩＡＧＥＮ的植物ＲＮＡ提取试剂盒。
参考见解：反转录的时候第一步加DNase处理: RNA 2ug 加DNase 1ul ,10x buffer 1ul,补DEPC水至10ul.放到PCR仪里37度30min，接着拿出来加stop solution 1ul停止反应 。然后72度10min(这一步是让RNA二级结构打开)以下就进行反转录步骤。
RNA提取中的酚使用的是水饱和酚还是Tris酚？PH值是多大？
参考见解：RNA提取一定要用酸饱和酚,pH在4.5左右. 水饱和酚是两相的，上层是水。分子克隆上推荐用水饱和酚的。酸性条件下，DNA将进入有机相，可以与RNA分开。
提取植物病毒的RNA，用于反转录成cDNA，请问下面的试验方案可行吗？存在什么问题？应该怎么样改进？
1、 称取0.5g病叶，加液氮研磨，迅速转入一支1.5ml的离心管；
2、 加入500ul酚/氯仿和500ul的RNA抽提缓冲液，振荡2min，4度12000rpm离心5min；
3、 上清用500ul酚/氯仿再抽提一次后4度12000rpm离心5min，加上与上清等体积的4M的Licl（有些资料中说用于反转录的RNA不能用Licl，对吗？），4度沉淀4hr以上；
4、 4度12000rpm离心15min；
5、 沉淀用70％的乙醇洗两次（乙醇是用来沉淀核酸的，此处用来不知何用？）；
6、 真空干燥后，沉淀溶于20ulDEPC处理的双蒸水中，－70度保存备用
参考见解：
1、 平时抽提动物组织中的RNA使用Trizol--Invitrogen公司生产的一种即用型的抽提总RNA的试剂，使用非常方便，在液氮研磨组织时加上Trizol，后面的过程与所写的相差不大，得率高，适合做RT。
2、 70%乙醇含有一定的水，以其洗涤可以使盐（此处为LiCl)溶解于上清中，从而去掉RNA中的盐分，减少对后续步骤的影响。
3、 “4度沉淀4hr以上”会不会太久了，太久的话RNA很容易被降解掉。无水乙醇通常用来沉淀RNA/DNA。
4、 实验室做植物病毒RNA的，对常规的方法改进了许多效果特别好。
1) 称取0.15克叶片，放入预冷的玻璃匀浆器中，加入预冷的1ml STE缓冲液和8μl β-巯基乙醇，研磨成匀浆。
2) 转移至离心管中振荡混匀。
3) 加入1ml水饱和酚，1ml氯仿/异戊醇(49:1)，充分混匀，冰浴中放置10分钟，中间混匀2～3次。
4) 台式高速离心机10000rpm，室温离心15分钟。
5) 小心吸取水相，加入1/10体积的3M NaAC (pH 5.2)和等体积的异丙醇，上下颠倒混匀。在－20℃中沉淀3小时。
6) 台式高速离心机11000rpm，室温离心20分钟，弃去上清。加600μl冰预冷70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥15分钟，至乙醇挥发完全为止。
7) 用50μl无菌双蒸水充分溶解提取的RNA。
从全血中提取总RNA,在加trizol之前步骤中所用的溶液也需要用DEPC处理吗?
参考见解：
1、 提取RNA所用的所有溶液都要用DEPC处理过的水配置，包括电泳，所用物品能烤的话就用烤箱240度烤上8小时，不能烤的（如枪头，EP）要用DEPC完全浸泡3-5天。
2、 如果用处理好的无RNAse的Ep管和枪头及提取全血专门的Trizol，可先用淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞，然后用一般Trizol提取RNA就可以了，效果也不错。Trizol之前没什么试剂，也不需要DEPC水处理。只要细胞还在培养基或缓冲液中，RNA基本就不会降解。
上一篇：针对RNA酶的一些注意事项 下一篇：RT-PCR反应体系酶的选择
共4页: 上一页 [1] 2 [3] [4] 下一页
