根据自己的喜好或经验以及课题的需要，从以下两条技术路线择一而行：
1. 化学合成三个靶点siRNA，在目标细胞株或最容易转染的同物种细胞株中筛选有效siRNA(即先筛选靶点)，然后根据有效打靶序列合成双链DNA并接入RNAi载体。该路线的好处是利用化学合成siRNA的快捷，并且在导入细胞和筛选过程中不会遇到RNAi载体的尴尬，即RNAi载体本身会给筛选过程带来干扰。与RNAi载体法相比较，如果目标细胞株很容易转染/转导，而且只需要观察短期内靶基因敲减后的细胞表型或基因功能变化，化学合成siRNA就足以满足课题要求，何必那么麻烦构建RNAi载体呢？
2. 直接构建RNAi质粒。即使最终目的是构建病毒型RNAi载体，也应该先用RNAi质粒筛选有效打靶序列。该路线的好处是自己构建载体，省钱！第二好处是筛选有效打靶序列后可以快速继续下游实验，如果RNAi载体上带有抗性标记，还可以用于构建shRNA稳定表达细胞株，这对于某些难转染细胞株来说可能是一个有效克服转染效率的办法。质粒可以反复扩增，用之不竭，也是一大优点。如果你手头有了RNAi质粒，打算自己构建RNAi载体，但是在打靶序列的双链DNA退火时遇到困难，可交由商业公司设计并合成双链DNA以期提高克隆效率。
如果目标细胞株较容易转染，而且靶基因在该细胞中的表达丰度不是非常低，那么利用半定量RT-PCR或定量PCR（SYBR Green染色法较便宜）或Northern Blot（注意Northern Blot所需细胞量较大）即可筛选有效RNAi质粒。如果细胞难转染或培养困难，或靶基因尚无相应抗体，建议先构建靶基因与报告基因或标签蛋白或多肽的融合表达载体，然后将三个靶点的shRNA表达质粒以及融合基因表达载体共转导/转染到同物种非常容易转染的细胞株中，进行非常重要的“靶点筛选/验证”工作，最后通过构建病毒型RNAi载体来实现稳定表达shRNA的目的。
另外，flyingpumc在下述帖子中提供了一篇可用于高通量筛选RNAi有效靶点的文摘：
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=87&id=705250&sty=3&keywords=RNAi+siRNA+shRNA《A novel approach for evaluating the efficiency of siRNAs on protein levels in cultured cells》的免费全文网址：
http://nar.oupjournals.org/cgi/content/full/32/2/e17 上一篇：siRNA对照解析 下一篇：多酚类植物(苹果,棉花)提取RNA protocol
