• RNA 干扰(RNAi)实验技术相关探讨

• 点击：    作者：51protocol收集   来源： 日期：2007-08-16    本站论坛

摘要：RNA 干扰(RNAi)是一种由双链RNA 所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi 技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。
关键词：RNAi；siRNA；转染
小RNA 作用与应用研究继2001，2002 连续两年被美国Science 杂志评为年度10 大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA 干扰（RNAi），即用20 多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi 沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小RNA 的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小RNA 对细胞行为的调控、如何利用RNAi 进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。

1、 RNAi 的作用机制

通过生化和遗传学研究表明，RNA 干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA 被切割为21-23 核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs， siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer 的酶，是RNase III 家族中特异识别双链RNA 的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA 降解为19-21bp 的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2 个碱基突出。在RNAi 效应阶段，siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC 需要一个ATP 依赖的将小分子RNA 解双链的过程。激活的RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA 转录本上，并在距离siRNA3’端12 个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC 都包含一个siRNA 和一个不同于Dicer 的RNA 酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA 在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段，这种dsRNA 可使内源相应的DNA 序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图1）：

图1、RNAi 的作用机制

2、RNAi 基本试验程序及注意事项
2.1、 siRNA 的设计
2.1.1、目标序列的筛选
在设计RNAi 实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：
http://www.genesil.com/business/products/order2.htm
RNA_finder.html">http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.1.2、RNAi 目标序列的选取原则
RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC 含量在45%—55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA 从而影响siRNA 的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
2.1.3、阴性对照
一个完整的siRNA 实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA 应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA 没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA 序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
2.1.4、目前已证实的siRNA 可以在下面的网页找到：
人源：
http://www.dharmacon.com/4DCGI/WEB_Menu/291027550/3310/20/4DWPG_0911115002
鼠源：
http://www.dharmacon.com/4DCGI/WEB_Menu/291027550/3310/22/4DWPG_0911115002
其他：
http://www.dharmacon.com/4DCGI/WEB_Menu/291027550/3310/23/4DWPG_0911115002
2.2、 siRNA 的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs 经RNase III 类降解 (e.g. Dicer， E. coli， RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA 表达载体或者病毒载体，PCR 制备的siRNA 表达框在细胞中表达产生siRNA。

2.2.1、体外制备
2.2.1.1、化学合成
当前，许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4 对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA 的情况下，需要大量siRNA 进行研究不适用于：筛选siRNA 等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.2.1.2、体外转录
以DNA Oligo 为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次
体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs 毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA 量的1/10 就可以达到化学合成siRNA 所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
2.2.1.3、用RNase III 消化长片断双链RNA 制备siRNA
其他制备siRNA 的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA 序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000 碱基的靶mRNA 模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA 后，这个siRNA 混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA 转染一样。由于siRNA 混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA 消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA 序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III 通常比用Dicer 要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。
现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA 进行研究，特别是基因治疗
2.2.2、体内表达
前面的3 种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA 转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA 表达载体和基于PCR 的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
2.2.2.1、siRNA 表达载体
多数的siRNA 表达载体依赖三种RNA 聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA， shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6 启动子和人H1 启动子。之所以采用RNA pol III 启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3 到6 个）U 来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2 段编码短发夹RNA 序列的DNA 单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA 表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA 表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA 序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA 序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
2.2.2.2、siRNA 表达框架
siRNA 表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR 得到的siRNA 表达模版，包括一个RNA pol III 启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III 终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA 表达载体不同的是，SECs 不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR 得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA 的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA 的最适搭配。如果在PCR 两端添加酶切位点，那么通过SECs 筛选出的最有效的siRNA 后，
可以直接克隆到载体中构建siRNA 表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA 和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR 产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocal 可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR 和DNA 合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA 序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
2.3、 siRNA 的转染
将制备好的siRNA，siRNA 表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：
2.3.1、磷酸钙共沉淀
将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH 都会导致磷酸钙转染的失败。
2.3.2、电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。

2.3.3、DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene 多聚体复合物和带负电的DNA 分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMSO 或甘油获得的渗透休克将DNA 复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
2.3.4、机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA 或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile 将大分子导入细胞。
2.3.5、阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb 的质粒会结合2-4 个脂质体。被俘获的DNA 就会被导入培养的细胞。现存对DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
2.4、 siRNA 的高转染效率需注意的几点事项
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
1.纯化siRNA 在转染前要确认siRNA 的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA 通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE 胶纯化）。
2.避免RNA 酶污染 微量的RNA 酶将导致siRNA 实验失败。由于实验环境中RNA 酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA 酶污染非常重
要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50 代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.避免使用抗生素 Ambion 公司推荐从细胞种植到转染后72 小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA 转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。
5.选择合适的转染试剂 针对siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA 实验的成功至关重要。
6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA 转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48 小时后统计对照蛋白或mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA 将导致细胞毒性以至死亡。7.通过标记siRNA 来优化实验 荧光标记的siRNA 能用来分析siRNA 稳定性和转染效率。标记的siRNA 还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞。
3、 制备siRNAs 或者dsRNA 试剂盒的选取
长片断的dsRNA 可以在植物、原生动物、昆虫、线虫中引发基因沉默。要研究这些对象，自己制备长片断的dsRNA 是很容易做到的：通过合适的质粒亚克隆——线性化——体外转录的方法，就可以自己合成dsRNA。目前已经有商品化合成dsRNA 的试剂盒（例如NEB 的HiScribe RNAi Transcription Kit，后文介绍）。但是在哺乳动物细胞中，超过30nt 的dsRNAs 则引起非特异基因沉默。实验表明，在哺乳动物细胞内引发特异的基因沉默最有效的siRNAs 是有19 个碱基互补，两边3'端各有2 个碱基突出（通常是UU，但是目前不清楚UU 对siRNAs 的活性影响有多大） 的一对21-mer 的dsRNAs。由于体外转录利用T7RNA聚合酶进行体外扩增的时候，通常要求序列的首2 个碱基为GG 或者GA 以提高合成效率，但是这两个额外的碱基会大大降低siRNAs 的活性，而且通常体外转录很难高效合成这么小的RNA（通常需在25nt 以上），因而早先哺乳动物细胞的RNAi 实验中用到的siRNAs 是用化学方法合成的，方便，简洁，不受碱基的限制。
可是不管怎么说，化学合成RNA 的费用是相当高的（一个碱基要将近400 元），特别是在哺乳动物细胞中siRNAs 的效率不一，一般一个基因需要设计3—5 对siRNAs 以确定最有效的，这样的费用就高了（就是6—10 条siRNAs（每条21nt），一个基因通常花费不少于20000）。如果需要重复设计，在国内还有时间上的困扰。
现在，多个厂家推出了不同的试剂盒，一个试剂盒可以自行设计合成多个siRNAs，灵活性和可控性都明显提高，不失为一种经济的选择。 例如在体外转录制备siRNA 时，Silencer™ siRNA Construction Kit——Lower Cost & Higher Potency siRNAs Ambion 公司的这个试剂盒是建立在体外转录的基础上的，其专利的设计有效克服了前面提到的难题，原理非常简单：首先合成两段29-mer 的DNA 作为模版（DNA 合成的价格就便宜多了，即
使是全球最著名的DNA 合成供应商Operon，也就是7、8 块钱一个碱基），包括8 个与T7启动子引物3'端匹配的碱基（称为引导序列，leader sequence）和21 个设计的siRNA 序列。将这两个模版和对应的T7 启动子引物分别混合，引物末端和DNA 模版褪火结合，用DNA聚合酶Klenow 大片断补平成为双链DNA 模版，分别用T7 RNA 聚合酶进行体外转录，将产物混合形成dsRNA，新的双链RNA 包含5'端单链的引导序列和中间互补的19 个碱基序列以及3'端两个重复的U（UU）。通过DNA 酶降解模版，同时用单链专一的核酸酶消化5'的引导序列，由于RNase 不能切开U 碱基也不能切双链RNA，所以得到的产物就是我们需要的21-mer 的双链siRNAs——有19 个碱基互补，3'端各有2 个U 突出。通过试剂盒提供的纯化小柱，去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质，得到的就是可以立即转化用的siRNAs！
4、 RNAi 存在的若干问题及其前景展望
目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。siRNA 在哺乳动物细胞中抑制mRNA 表达是有效的，但并不能象果蝇细胞那样完全抑制目的基因的表达，可能是因为生物体是一个复杂的系统，存在多种机制相互作用以调控基因的表达。另外，在哺乳动物中，RNAi 能否成功地抑制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型。对线虫来说，可以采用注射、浸泡或喂食的方法转入dsRNA，而对哺乳动物来说，寻找高效的方式来转入siRNA 以及快速的方式来筛选RNAi 尚需进一步探索。RNAi 在抗病毒感染中的应用
令人振奋，但能否成功还无法保证。在研究中亦有诸多困难：（1）并不是所有的病毒RNA序列都能比较容易的接近siRNA，被识别、切割。有些病毒靶序列可能隐藏在二级结构下，或者位于高度折叠的区域中，而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合物，阻碍了与siRNA 的识别。（2）病毒的复制过程并不严格，随意性很强，因此往往产生突变的子代。这一特点能够帮助病毒躲避机体的免疫监控和药物的抑制作用，同时也会干扰siRNA 的识别。（3）在siRNA 的导入问题上，同样也面临着技术上的困难。（4）因为细胞内的RNA 酶会降解siRNA，故怎样保证siRNA 的稳定性仍是一个亟需解决的问题。尽管目前对RNAi 的研究还不够深入，RNAi 还不够完善，但这种现象在自然界是普遍存在且有效的，其应用前景十分广阔。它不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展，还有可能设计出RNAi 芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用RNAi 技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。从发现RNAi 现象至今，只有短短的几年时间，但由于它的重要作用，使其成为生命科学中的研究热点。今后的研究应主要集中于RNAi 作用的机制及如何进一步完善RNAi 技术。
可以相信，RNAi 技术必将为生命科学研究和临床治疗带来新的革命。

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