| 一．siRNA的设计
在制备siRNA前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小，3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物细胞，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。
选择siRNA靶位点：
从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为侯选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’端和3’端的非编码区（untranslated regons, UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
序列同源分析：
将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能始位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。通常来说，每个目标序列设计3-4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。
设计阴性对照：
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。
此外网上提供提供免费的siRNA设计工具RNA">www.qiagen.com/siRNA,
http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/
二．siRNA的获得
1．化学合成
尽管化学合成siRNA是最贵的方法，但却是最方便的---研究人员几乎不需要做什么工作就可以拿到高质量的siRNA。如QIAGEN-Xeragon公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA（可带标记）。它最适用的情况是：已经找到最有效的siRNA序列，需要大量siRNA进行研究。QIAGEN还提供siRNA设计合成一体化服务“4-for Silencing siRNA duplexes” : 针对客户给出的一个基因序列，由QIAGEN的专家设计并合成4对siRNA，HPP纯度，保证至少一对抑制效率达到70%以上，如果达不到，免费为客户另行设计合成另外4对siRNA。
Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6×104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit eith primers targeted to lamin.
2. 体外转录
1）长链dsRNA合成
如果研究对象不是哺乳动物细胞，可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象。我们可以DNA Olido为模板，通过体外转录合成dsRNAs，成本相对化学合成法而言比较低。目前市场上有很多这样的体外转录试剂盒，象NEB，EPICENTRE都提供类似的试剂盒。
2）特异性siRNA合成
多数生物尤其是哺乳动物，siRNA仍是诱导RNAi的最佳选择。以DNA Oligo为模板， 通过体外转录合成siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等效果。这类方法主要适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，以及化学合成的价格成为障碍时。Epicentre MessageMuter™ shRNAi Production Kit 专为体外转录合成shRNA而设计，尤其适用于哺乳动物的RNA干扰研究。使用独特的3步法，在3小时内即可合成可以立刻转染的shRNA，比其他的体外转录方法更加快速、简便。该试剂盒提供足够的试剂合成10个不同的shRNAs，每个shRNA产物的量足够上百次常规细胞转染实验。此外，试剂盒还提供内参模板，每种shRNA的合成只需要合成一条寡核苷酸链即可。（见figure 2）
Figure 2: 首先以DNA为模板，通过体外转录合成双链长RNA（dsRNA），即将DNA克隆入LITMUS转录载体中。该载体携带相反方向的T7启动子，可利用单一T7启动子特异引物进行扩增，产生双链的DNA模板，其末端由T7启动子特异引物而决定，当使用其它PCR特异引物时，末端应该携带T7启动子。随试剂盒所提供的生物素标记T7启动子引物可用于扩增两个T7启动子间的所有序列。扩增后带有生物素标记的扩增片段可利用链霉亲和素标记的磁珠进行分离，并且直接用作转录模板。
3）非特异性siRNA合成
特异性制备siRNA方法的不足，是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法---制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。这个方法通常选择200-1000碱基的靶mRNA模板，用体外反转录的方法制备长片段双链dsRNA，然后用RNaseIII或（Dicer）（大肠杆菌RNaseIII是一种识别双链RNA的内切酶，产物为3’端外悬2-3个碱基的双链短片段）在体外消化，得到siRNAs “混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的长链dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，转染方法和特异性siRNA一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能保证目的基因被有效抑制。NEB公司的ShortCutTM RNAi Kit 就是采用此类方法的试剂盒。该试剂盒不仅提供能在体外高效制备双链长RNA的转录试剂，而且还提供了高浓度RNaseIII酶（shortCut RNaseIII），能将转录后的片段切割成双链短RNA（18-25bp）。
试剂盒组成: T7 RNA聚合酶 (150 units/μl)，10×缓冲液/NTPs，30×高分子量成分混合物(HMW)，生物素化T7引物，LITMUS 38iluc 对照模板DNA (0.1 μg/μl)
加工处理试剂: ShortCut RNaseIII (1.3 units/μl)，10×ShortCut反应缓冲液，10×MnCl2 (200 mM)，10×EDTA(250 mM)，21 bp siRNA 分子量标准(1 μg)，无RNA酶的糖原(10 μg/μl)，10×缓冲液/NTPs。
（见figure 3, 4, 5）
Figure 4: 利用ShortCut RNaseIII制备siRNA： A) 不同量的ShortCut RNaseIII与分别与2 μg 500 bp的dsRNA反应20分钟。B) ShortCut RNaseIII消化dsRNA (1 kb和175 bp), 消化产物采用20% TBE聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
Figure 5: 沉默COS-7细胞GFP的表达：将GFP表达质粒与采用ShortCut siRNA Kit制备的GFP siRNA（30 ng，4nM）共转染COS-7细胞；只转染GFP表达质粒的COS-7-GFP细胞作为阴性对照。转染后48小时进行拍照。
非特异性siRNA合成，尽管特异性不强，无法确知有效靶片段，但相对经济，基因沉默效率高；可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因沉默。
3．siRNA表达载体
化学合成和体外转录法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒，病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。
通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III 启动子启动编码shRNA (small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4-5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因的表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其他合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。
此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。目前BD CLONTECH公司的RNAi-Ready pSIREN载体就是这样的产品（原理如figure 6）：
BD Clontech RNAi-Ready pSIREN载体采用U6启动子，均为线性载体。具体可分为两种:
pSIREN-Shuttle载体和pSIREN-RetroQ载体。（见figure 7）
pSIREN-Shuttle载体可以进一步应用于构建腺病毒，应用于感染难以转染的细胞。
pSIREN-RetroQ载体可以进一步应用于构建逆转录病毒，除了可以感染难以转染的细胞，还能通过与宿主细胞基因组DNA的整合，实现siRNA的细胞内长期稳定表达。同时，pSIREN-RetroQ载体还带有真核筛选标记----嘌呤霉素抗性基因。极大的方便了阳性转染细胞的筛选。
所有的质粒都含有阳性对照（萤光素酶siRNA的DNA模板）和阴性对照。
同时BD Clontech还提供对照质粒，包括pSIREN-Shuttle、pSIREN-DNR、pSIREN-RetroQ三种载体的萤光素酶阳性对照和阴性对照。
BD clontech公司新推出的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 和 pSIREN-DNR-DsRedExpress是带有荧光蛋白基因的即用型RNAi载体。这些荧光蛋白（分别为绿色荧光和红色荧光）不需要加任何辅助因子或底物就可以在许多细胞系中表达。由于这些蛋白发出的荧光非常强，可以用荧光显微镜或者是流式细胞仪来观察。不但可以直接观察转染的效果，还可以收集阳性转染细胞。同时荧光蛋白的表达和shRNA的表达时独立的，因此不影响shRNA基因沉默的效果。RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen可以作为质粒操作，也可以通过相应的细胞系包装成重组逆转录病毒；pSIREN-DNR-DsRedExpress Vectors则可以通过Knockout Adenoviral RNAi System 2来包装成重组腺病毒。（见figure 8）
Figure 8. Fluorescent RNAi-Ready pSIREN vectors generate effective, tagged shRNA expression cassettes (SECs). Using the BDTM Knockout RNAi Clone & Confirm PCR Kit, fluorescence-tagged SECs were generated by PCR from ligation mixtures of a negative control (–) or a luciferase ( ) shRNA annealed oligo, and an RNAi-Ready pSIREN vector with a fluorescent marker. The PCR-generated SECs were subsequently cotransfected with pCMV-Luc into HEK 293 cells. Luciferase activity was measured 48 hours after transfection. Shown are ZsGreen-tagged (Panel A) and DsRedExpress-tagged (Panel B) SECs in cotrans-fected cells. The SECs effectively knock down luciferase expression by >85% (Panel C).
如何有效的将siRNA或者siRNA表达载体导入目标细胞是RNAi实验的关键步骤，影响RNA干扰的最终效果。对于一些难以进行转染的细胞，用传统的转染方法通常很难取得好的效果。BD?Clonteh公司最新推出的Knockout RNAi 系统和 RNAi-Ready pSIREN 载体充分利用了病毒对宿主细胞的高效侵染性，彻底克服某些细胞转染效率低的障碍，是实现哺乳动物细胞siRNA瞬时表达与稳定表达的理想工具。(见figure 9)
BD™ Knockout Adenoviral RNAi Systems 系统能快速、方便的形成表达发夹结构的siRNA的重组腺病毒，从而有效的侵染到各种宿主细胞。
BD Knockout Adenoviral RNAi System 1使用RNAi-ready pSIREN Shuttle vector，通过酶切连接构建腺病毒DNA质粒。包装成腺病毒颗粒后可以感染分裂及非分裂期的宿主细胞，可实现高水平表达。系统中包括RNAi-ready pSIREN Shuttle vector，阳性对照（萤光素酶siRNA的DNA模板）和阴性对照。同时 BD Clontech还提供一系列的腺病毒实验相关工具。（见figure 10）
BD Knockout Adenoviral RNAi System 2使用pSIREN-DNR Vector，运用了同源重组的技术，即Creator技术，快速得到腺病毒DNA质粒，简化了筛选有效siRNA过程中烦琐的克隆步骤。系统中包括RNAi-ready pSIREN-DNR vector，阳性对照（萤光素酶siRNA的DNA模板）和阴性对照。(见figure 11)
BD Clontech pSIREN-RetroQ 逆转录病毒载体能进一步包装成重组逆转录病毒，高效感染处于分裂期的目的细胞，并将自身携带的质粒整合到宿主细胞的基因组中，从而快速获得稳定表达siRNA的细胞系,这对于进行长期RNAi研究带来了极大的便利。
4．siRNA表达框架
siRNA表达框架（siRNA expression cassettes, SECs）是一种由PCR得到的siRNA表达模板，包括一个RNA pol III 启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。它能够直接导入细胞进行表达而无需先克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆，测序验证等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不到一天就可以完成。因此，SECs是筛选siRNA的最简单有效的工具，可作为构建高效的体内转录载体进行RNAi研究的预实验，对不同宿主细胞优化筛选转录启动子和siRNA靶序列。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是PCR产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那可以解决很大问题。另外，不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能发生的误读不能被发现，可能会因此导致结果不理想。
三：转染细胞
由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此如何高效地将siRNAs转入细胞也是成功抑制基因表达地关键步骤。例如，一个siRNA分子对某特定基因地抑制效率为90%，而转染效率为10%，那么最后抑制蛋白表达最后地效率只有9%，可见如何提高siRNAs的转染效率非常重要。目前传统转染方法与转染试剂盒很难达到高效率的siRNAs转染，效果都不理想。QIAGEN公司的RNAiFect是专门的RNAi转染试剂，它的原理基于脂质体技术，适用于多种真核生物细胞，如AGS，HEK-293，HeLaS3, Huh-7, HUVEC, NIH-3T3等等。（具体效果见Figure 1）,而且试剂的细胞毒性很低。（见figure 13）
Figure 13: Cells were transfected and LDH activity in the cell culture supernatant was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufacturer’s protocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed be detergent was set to 100%. Background LDH activity was measured in untransfected and untreated cells, and this value was subtracted from all other measurements.
对于siRNA表达载体与表达框架等DNA的转染，可以选用常规的DNA转染试剂。
四．分析RNAi效果
RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用RT-PCR，定量PCR，或Northern Blot技术等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。对于蛋白水平的检测，克通过WB，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程，生理生化系数等参数发生明显的变化
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