自己动手合成siRNA

——使用T7 RiboMAX™表达RNAi系统合成具有功能的siRNA和发夹siRNA

摘要：
我们开发、优化了一种采用T7 RNA 聚合酶和退火的DNA寡聚核苷酸模板，体外合成短干扰RNA（siRNA）或发夹siRNA方法。在不同的哺乳动物系统中进行的RNA干扰研究表明合成的siRNA是有功能的。体外有效、廉价地合成siRNA有助于快速筛选多个靶点，识别具有强烈沉默效应的siRNA。

T7 RiboMax™ Express RNAi Syestem可用于体外快速、有效地合成siRNA或发夹siRNA，在哺乳动物细胞中进行RNA干扰研究。

前言
RNA干扰是一种双链RNA（dsRNA）通过激活互补的靶mRNA的特异降解来抑制靶蛋白表达的现象（综述见参考文献1及其相关文献）。RNA干扰是研究基因功能的有力工具，研究人员可通过敲除或下调靶蛋白的表达水平研究基因的功能。

RNAi涉及许多步骤，包括RNaseⅢ家族成员（如：果蝇的Dicer）识别dsRNA，并将其切割为21－23个核苷酸的siRNA (2-4)。siRNA整合成RNAi靶复合物RISC（RNA诱导的沉默复合物），从而破坏了复合物中与siRNA结构同源的mRNA（3，4）。

在大多数哺乳动物细胞中，引进长链dsRNA（>30bp）可诱导潜在的抗病毒反应，导致mRNA降解，并阻止蛋白合成（5）。然而，化学合成的siRNA在很多哺乳动物细胞中能诱导特异的基因沉默，而不引起非特异的抗病毒反应（2，6）。最有效的siRNA双链长度为21个核苷酸，包括19bp的双链序列，每个3'末端为2个尿嘧啶的突出端（7）。

研究表明在体外可采用T7 RNA聚合酶成功合成有功能的siRNA和发夹siRNA（8，9）。采用T7RNA聚合酶合成siRNA的唯一要求是靶mRNA中含有GN17C序列，因为T7 RNA聚合酶偏爱核苷酸G作为转录起始位点（10）。

T7 RiboMax™ Express RNAi Syestem可用于体外快速、有效合成siRNA或发夹siRNA，在哺乳动物细胞中进行RNA干扰研究。另外，该系统也可合成较长的dsRNAs，用于许多非哺乳动物细胞的RNAi研究 (11)。和其它标准的体外转录反应相比，该系统对缓冲体系、NTP浓度、T7RNA聚合酶、无机焦磷酸化酶及镁离子水平进行了优化，RNA产率大大增加。

用RiboMax™系统合成siRNA

图1显示了采用T7 RiboMax™ Express RNAi 系统合成siRNA的流程图。第一步是合成DNA模板，即2条DNA寡聚核苷酸退火形成双链，一般20μl体外转录反应需要加入20 pmol双链寡聚核苷酸。采用T7 RiboMax Express T7缓冲液和酶混合物可在30分钟内有效合成RNA。而后加入DNase消化除去DNA模板，而彼此分离的RNA单链可退火形成siRNA。这种单链小RNA可自身退火形成发夹结构。采用醋酸钠和异丙醇沉淀siRNA，产物溶解后可在聚丙烯酰胺凝胶上检测产物的大小和完整性。用凝胶分析或RiboGreen(r)分析（Molecular Probes）对siRNA进行定量分析。

图1.采用T7 RiboMAX™ RNAi表达系统产生和纯化siRNA的操作步骤

我们采用T7 RiboMAX™ Express RNAi 系统合成了针对多个靶点的21bp siRNA，包括发夹siRNA。每种siRNA在体外转录和纯化后，在4－20％还原聚丙烯酰胺凝胶上进行检测，并和相同大小的化学合成的siRNA进行对比。如图2所示，体外合成的siRNA和化学合成的siRNA迁移率是一致的，较大的发夹siRNA迁移较缓慢，与预期一致。

表1显示了用不同的退火DNA寡聚核苷酸为模板合成siRNA或发夹siRNA的产率，一般而言，每毫升反应体系中，siRNA产量>500μg，发夹siRNA的产量为1mg。对任何一种特异的模板，使用者可通过增加孵育时间（从30分钟到2小时）或提高转录反应温度（用42℃替代37℃）来提高siRNA产率。这可以增加富含GC或含有二级结构的模板的转录效率。

图2：采用T7 RiboMAX™ Express RNAi 表达系统产生的不同siRNA分子的还原聚丙烯酰胺分析图谱。每种siRNA取大约50ng在4-20%TBE PAGE凝胶上进行分析，用TBE为电泳缓冲液。电泳后凝胶用0.5ug/ml溴化乙锭染色。泳道1为10bp DNA Step Ladder（G4471）；泳道2为化学合成的21bp海肾siRNA（Dharmacon），泳道3是T7 RiboMAX™ Express RNAi 表达系统合成的21bp海肾siRNA，泳道4是T7 RiboMAX™ Express RNAi 表达系统合成的21bp p53 siRNA，泳道5是T7 RiboMAX™ Express RNAi 表达系统合成的长度为49个核苷酸的shRNA（19bp的双链结构，含有9bp的环状结构以及2个尿嘧啶的3’突出端）。注意：siRNA比双链DNA迁移慢。

模板设计及考虑因素

采用体外转录产生小RNA所使用的模板DNA是退火的寡聚核苷酸双链。T7 RNA聚合酶启动子序列被整合到该模板的正义链和反义链，用以启动转录反应。为保证T7 RNA聚合酶的有效转录起始，靶序列必须包含序列5'-GN17C-3'。核苷酸。一个模板转录正义RNA链，另一个模板转录反义RNA链，图3显示了这些核苷酸的序列要求。这两条互补的DNA寡聚核苷酸模板分别转录后，正义和反义RNA链可退火形成siRNA。

用含有两段互补的寡聚核苷酸序列的DNA为模板，可产生一个发夹siRNA。一些研究表明，短发夹siRNA（shRNAs）包含19个完全配对核苷酸，中间有不同的间隔区域，并且其末端是2个核苷酸的3'突出端，可以象siRNA一样，有效地诱导RNA干扰(8,12-17) 。合成shRNA需要两条长的寡聚核苷酸，退火后变成RNA链合成的模板。这种RNA可自身退火形成发夹结构。图3显示的环的长度及序列来源于参考文献13。

每种shRNA需要一条退火的DNA寡聚核苷酸为模板，因此总共需要2条寡聚核苷酸。这些寡聚核苷酸的序列要求参见图3。

表1用T7RiboMAX™RNAi 表达系统合成六个不同的siRNA模板（每个模板三次复制产量的平均值）
siRNA样品	产量（mg siRNA/ml反应）
Renilla Site 1 siRNA		0.85
Renilla Site 1 hairpin siRNA		4.20
Renilla Site 2 siRNA		1.50
Renilla Site 2 hairpin siRNA		2.10
Renilla Site 3 siRNA		1.20
Renilla Site 3 hairpin siRNA		1.70

为了检验用T7 RiboMAX™ RNAi 系统合成的siRNA或shRNA在哺乳动物细胞中可进行RNA干扰，我们采用了两种不同的模型系统进行测试。一个系统靶点为一个稳定整合的外源报告基因，而另一个系统靶点是内源的转录因子基因。

将稳定表达海肾荧光素酶的CHO细胞转染由T7 RiboMAX™系统合成的siRNA或shRNA，每种siRNA均采用化学合成或体外合成。用另一个siRNA分子进行转染作为阴性对照，该分子包含有靶点mRNA所具有的各种单核苷酸，但序列不与靶点互补（“杂乱”siRNA）。图4显示了和“杂乱”siRNA对照相比，海肾荧光素酶活性的平均抑制程度。对于三个不同的靶点，体外合成的siRNA的抑制程度和化学合成相同序列的siRNA相当。另外，体外合成的shRNA和其它siRNA的功能具有可比性。因此，采用T7 RiboMAX™ System合成的siRNAs或shRNAs和化学合成的siRNAs具有同等的诱导RNA干扰的功能。

另一个哺乳动物模型涉及到对内源靶点的表达。我们选择了转录因子p53，它是人类肿瘤中最常发生突变的肿瘤抑制因子（18）。P53蛋白半衰期较短，但可通过点突变或特定DNA肿瘤病毒蛋白，如SV40大T抗原的作用使其稳定。 为测试对P53蛋白的抑制，我们使用了293T细胞系，因为它含有SV40大T抗原，可以稳定P53蛋白质，使 P53有高水平积累。用“杂乱”siRNA，化学合成的p53 siRNA，或采用T7 RiboMAX Express RNAi 系统合成的p53 siRNA进行转染。结果显示化学合成的和体外转录的p53 siRNA能够降低p53的蛋白水平。采用T7 RiboMAX™ Express RNAi 系统合成的p53 siRNA和化学合成的相同序列的p53 功能相当。

mrna Target:5＇-G1 N2 –18 C19-3＇

Complement:3＇-C1 N2-18G19-5＇

Oligonucleotides for siRNA production:

Oligo 1(top strand for sense):5＇-GGATCCTAATACGACTCACTAATA-G1N2-18C19-3＇(G1N2-18C19=sense Mrna sepuence)

Olige 2 (bottom strand for sense)3＇-CCTAGGATTATGCTGAGTGATAT-C1N2-18G19-AA-5＇

Olige 3(top strand for antisense):5＇-GGATCCTAATACGACTCACTAATA-G19N18-2C1-3＇(G19N18-2C1=antisense mrna sequence )

Oligo 4(bottom strand for antisense)：3＇-CCTAGGATTATGCTGAGTGATAT-C19N18-2G1-AA-5＇

Oligonucleotides for Hairpin siRNA Production:

Oligo 1 (top strand for hairpin):5＇-GGATCCTAATACGACTCACTAATA-G1N2-18C19(sense)-TTCAAGAGA(loop)-G19N18-2C1(antisense)-3＇

Oligo 2 (bottom strand for hairpin):3＇-CCTAGGATTATGCTGAGTGATAT-C1N2-18G19(sense)-AAGTTCTCT(loop)-C19N18-2G1(antisense)-AA-5＇

图3.产生siRNA 或发夹siRNA的模板所需要的DNA寡聚核苷酸。靶mRNA的正义序列被认为是蛋白编码序列。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
图4. 比较用化学合成的或用T7 RiboMAX™ Express RNAi 系统提外合成的三种不同的海肾siRNA对海肾荧光素酶表达的抑制程度。将针对hRluc mRNA三个不同位点的siRNA各20ng转染稳定表达优化密码子的海肾荧光素酶基因（hRluc）的CHO细胞。另外，对相同3个位点的体外合成的shRNA也进行检测。用一种“杂乱”siRNA作为阴性对照，用化学合成的siRNA作为阳性对照（Dharmacon）。采用siLentGene™ Transfection Reagent在96孔板中进行转染，每种siRNA转染8个复孔。转染后24小时，4个孔用海肾荧光素酶分析系统分析hRluc的活性，4个孔用CellTiter-Glo^® 发光细胞生存分析系统检测细胞的数目。对每种siRNA的转染，计算平均hRluc信号与平均CellTiter-Glo^® 信号的比值，并计算该比值与阴性对照组该比值的差值。

图中显示的数据是与“杂乱”siRNA的转染相比，海肾hRluc信号/CellTiter-Glo^® 分析信号之比值下降的百分比。D=从Dharmacon化学合成的siRNA；P=用T7 RiboMAX(tm) Express RNAi 系统体外转录的siRNA；HP=用T7 RiboMAX™ Express RNAi 系统体外转录的shRNA。所有体外合成的siRNA和shRNA用技术手册TB316介绍的技术进行合成和纯化，并在2.5%琼脂糖/1×TAE凝胶上进行定量，用已知量的化学合成的siRNA作为对照。电泳后凝胶用1:10,000 SYBR(r) Green Ⅱ（Molecular Probes）染色20分钟，而后用Molecular Dynamics Storm(r)荧光扫描仪进行扫描定量（blue mode; PMT=1,000）　　

图5：内源p53蛋白的抑制。将293T细胞接种到12孔板上，24小时后采用siLentGene™转染试剂转染 200ng“杂乱”siRNA (泳道1)，200ng体外合成的p53 siRNA (泳道2)，或200ng化学合成的p53 siRNA (泳道3)。转染后24小时，用含有蛋白酶抑制剂的1×Reporter Lysis Buffer（产品目录号：E3971）裂解细胞，并用BCA Protein Assay (Piece)进行蛋白定量。取相同量的裂解液（10μg）在4－12％聚丙烯酰胺Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上电泳分离，并转到Hybond^®-C膜上。用p53抗体（Calbiochem）和β-actin（Abcam）抗体进行杂交。采用山羊抗鼠HRP二抗及Transcend™ Chemiluminescent Non-Redioactive Translation Detection System（产品目录号：L5080）化学发光检测试剂进行检测。杂交膜用Kodak X-OMAT^®胶片曝光4分钟。另外，同时检测β-actin蛋白以控制上样量和转膜过程。图中标出了p53和β-actin的条带，分子量大小与预期的一致。

结论

T7 RiboMAX™ Express RNAi 系统可快速、有效合成siRNAs或shRNAs，从而进行哺乳动物RNA干扰的研究。一般是每毫升反应体系可产生1－2mg siRNA或shRNA。该系统的唯一要求是用包含目的序列的dsDNA为模板。体外合成方法简单，可对单一靶点产生多种siRNA，从而可快速合成和筛选对靶蛋白高度抑制的siRNA。

参考文献：

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