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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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如何测量RNAi的效果？
检测基因特异阻断的最常用的方法是进行western blot分析，比较导入siRNA前后蛋白表达水平的变化。在一些情况下可能使用检测报告子基因的报告子系统例如β-半乳糖苷酶。也可以应用实时PCR（例如通过使用LUX™引物）或者其它类型基于细胞的分析检测细胞中转录本的水平。
如何知道什么序列具有RNAi效应？
为了分析特异siRNA序列在基因活性上的效应，必须知道导入siRNA的序列。这将要求设计合成寡核苷酸或者载体上的短的发夹RNA（siRNA）序列，转染后检测基因的阻断。而dicer酶切的siRNA（d-siRNA）导入细胞后，由于d-siRNA库中通常都有好几种有效的siRNA序列，它们在起始RNAi反应尤其有效。然而目前还没有方法确定在这个库中起作用的特异的序列。
有关BLOCK-iT™载体的问题：
为什么使用载体导入shRNA？
在哺乳动物细胞中，RANi可以通过直接导入特异阻断所选择基因表达的分子而诱导，导致产生基因功能缺失表型。这些分子可以通过化学合成、体外方法制备或者细胞内DNA模板产生。前两种方法只能用于瞬时阻断，可能很难导入难以转染的、不分裂的或者原代细胞类型。通过载体导入pol III 启动子表达的短的发夹RNA（shRNA）扩展了RNAi实验的选择，包括稳定和可诱导表达以及病毒导入。
为什么使用pol III型启动子？
使用pol III型启动子是为了有效表达shRNA。这些pol III型启动子包含了表达RNA上游所有的必要的元件，而且在一个短的多聚胸苷区内终止。一旦shRNA被表达，它被转移出细胞核，在细胞质中被Dicer加工成siRNA。Dicer优先识别由 pol III型启动子产生的shRNA，因为它们不带有5’或者3’两侧连接的序列。siRNA进入RISC复合体中，在哺乳动物细胞中产生RNAi效应。
H1启动子和U6启动子有什么差别？
BLOCK-iTTM可诱导H1和U6入门载体试剂盒（BLOCK-iT™ Inducible H1 and U6 Entry Vector Kits）分别使用Pol III依赖H1或者U6的启动子。H1启动子经过修改，其中包含两个四环素操纵子2（tetracyline operator TetO2），允许从这个启动子表达的shRNA在表达四环素抑制（TR）蛋白的细胞中调节表达。尽管H1和U6是polⅢ 型启动子，然而可能根据使用细胞系的不同，效率有些小的差别。
什么时候应该使用pLenti6/TR？
pLenti6/TR是基于慢病毒的载体，可以产生在CMV启动子控制下高水平表达四环素抑制子（TR）的稳定细胞系。使用慢病毒导入方法意味着，基因可以特别有效地导入和高效地整合到难于转染的细胞、原代和不分裂细胞中。表达TR的细胞能够使用杀稻瘟菌素（Blasticidin）进行筛选。pLenti6/TR载体设计可以与BLOCK-iT™可诱导H1慢病毒RNAi系统以及ViraPower™ T-REx TM慢病毒表达系统一起使用。
有关BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit和BLOCK-iT™ Dicer RNAi Transfection Kit问题：
什么时候使用体外Dicer酶切方法最好？
Dicer是进行早期RNAi分析的出色的工具，提供：
· 产生申请基金和发表文章所需要的有效的RNAi数据
· 若干基因的最初筛选，以选择那一个是最有兴趣跟踪的基因
· 分析基因某一特殊部分的阻断效应
· 敲除某一特殊基因的所有剪切体或者所有的家族成员
使用d-sRNA进行RNAi分析时，我能预期看到脱靶背景吗？
考虑以什么序列作为Dicer的底物是重要的。尽管我们生产能够阻断基因表达的更小的siRNA双链（∽200碱基）上一直是很成功的，但是Dicer切割500-1000碱基的长的ds-RNA效果最好。选择目的基因合适的区域扩增和转录也是很重要的。为了避免非特异的阻断效应，不要转录保守区域，选择一个对于目的基因特异的基因区域。Dicer的独特性在于，它也能提供扩增保守基因区域的机会，因而如果需要，整个基因家族的表达可能被阻断。
使用Dicer和RNaseIII裂解dsRNA有什么差别？
RNaseIII酶裂解长的ds-RNA明显的要比Dicer裂解的片段小（12-15核苷酸）。有报道表明，这些裂解的片段可以有效的产生RNAi效应，尽管可能需要更多的产物转染以达到阻断。Dicer酶是真核细胞内源RNAi路径中的天然组分，在优化步骤中使用纯化的重组Dicer裂解长dsRNA成特别的大小siRNA，已知可以有效地产生阻断反应。
我必须选择BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit产生的长dsRNA作为BLOCK-iT™ Dicer 的作用模板吗？
BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit是可以产生高质量、高产量dsRNA,是用来合成作为Dicer底物的dsRNA的理想试剂盒。其它来源的dsRNA效果也不错。
BLOCK-iT™ Dicer RNAi Transfection Kit和BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit配置如何？
Invitrogen公司试剂盒的配置为你提供进行RNAi实验所需要的一切。你只需要提供dsRNA底物，或者使用BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit（包含在BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit）产生你的dsRNA。
BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit提供对多达5个基因的在24孔板进行超过150次转染实验的足够的试剂，明显地比其它Dicer试剂盒提供更多次的转染实验。BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit提供：
· 高质量制备的BLOCK-iT™ Dicer酶
· 纯化d-siRNA的RNAi纯化试剂
· 在哺乳动物细胞中高效转染d-siRNA的Lipofectamine 2000 如果你希望使用真正最佳的invitrogen公司的试剂制备你的dsRNA底物，完成Dicer酶切反应，我们推荐使用BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi Kit。这些试剂盒也包含一个易于使用的RNAi纯化模块和分离dsRNA(BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit)或者d-siRNA（BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit）的最佳程序。这些对于获得最佳结果至关重要。长dsRNA的纯度可能影响它作为底物进行Dicer酶切反应的效果。高效的ds-RNA的纯化是必要的，因为产品如果没有进行完全纯化来去除长dsRNA，可能会启动总的细胞关闭反应（general cell shutdown response）。我们的BLOCK-iT™ TOPO® Transcription Kit包含了最卓越的siRNA转染试剂，Lipofectamine 2000，确保高效的转染和实验的成功

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RNAi常见问题及问答（FAQs）

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-08-16 　本站论坛

二者的分子结构是相同的，dicer将长dsRNA特异的裂解为21-23个核苷酸双链，具有siRNA标志的两个核苷酸的突出。主要的差别是d-siRNA是包含一个来源于一个完整全长的dsRNA靶标的siRNA库，而siRNA通常是指特异针对专门靶定区域的单一序列，通常合成为单一Oligo或者特异几种Oligos混合物。