siRNA制备方法（how to get siRNA?）

In vitro
A.. 化学合成法
Ｂ、体外转录
Ｃ、酶切长链dsRNA
In vivo
Ｄ、载体表达siRNA
Ｅ、PCR合成siRNA表达元件

A. 化学合成法
1.方法简单、快速，需要时间短；获得的siRNA纯度高
2.适用于短期体外实验研究，尤其适用于需要单一siRNA序列的研究
3.siRNA可进行标记
4.需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列
5.不适用于长期研究
6.不适用于siRNA序列的筛选

siRNA序列设计注意事项
1.选择以AA开头的19-21nt长的序列
2.靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游75-100nt处结束
3.选择 2-4个靶定序列，以筛选特异性最好的进行实验
4.选择的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。
5.若需要发卡结构，发卡部分长度一般为6-9nt，有文献报道9nt效果较好.
6.最后,选择的DNA 片段经BLAST 查询,应与其它人类基因无同源性
7.设定适当的对照

设置适当的siRNA对照
1) 与靶定siRNA有相同的碱基组成，但排列完全不同，且不与其它基因由同源性
AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6)
ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6)
2)1-2碱基错配的 siRNA对照 (1-2nt)
AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG
AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T 和 A错配

siRNA序列设计
根据文献报道，使用确定的siRNA序列
许多网站提供siRNA设计软件，只需输入靶定基因序列，即可提供候选siRNA序列；比如Ambion公司,武汉晶赛

B、体外转录合成短的siRNA
1.T7 RNA 聚和酶体外转录DNA，直接产生小片断的siRNA，
2.快速、灵活，适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时
3.siRNA可进行标记
4.可重复性差，不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究
( 使用 T7 RNA 聚合酶需要转录的RNA前两个核苷酸为GG or GA 以保证高的合成效率 (Milligan 1987). 在siRNA的5‘ 需要是GG or GA 序列，同时在3’端又需要有两个UU ；这就极大的减少了可能的siRNA的靶位点 这些限制了体外转录作为产生siRNAs稳定的方式)

(体外合成一段目的基因的寡核苷酸（有义链和反义链），其3‘端含有8个碱基与Ｔ７启动子序列互补；将Ｔ７启动子与模板混合，Ｋｌｅｎｏｗ酶补平，使用Ｔ７ＲＮＡ酶进行转录。杂交，消化、纯化 )

C、 使用Dicer酶切长片断dsRNA产生siRNA
1.使用T7RNA聚和酶体外转录,产生长片断的dsRNA，然后使用Dicer酶消化，产生短的siRNA
2.产生的为siRNA的混合物，因此沉默效果较好
3.该方法方便、简单、需要时间短，容易操作适用于快速而便宜的表型功能缺失研究
4.可对产生的siRNA进行标记
5.不适用于长期研究和需要确定的单一siRNA的研究
6.可能产生非特异性的基因沉默

D1、质粒载体合成siRNA（非病毒）
首先合成具有发卡结构的DNA，构建到含有U6 或者H1 启动子的质粒中，质粒转入细胞，在启动子操纵下转录生成siRNA;
该方法可在胞内持续产生siRNA，适用于长期研究;
价格较贵，构建过程相对复杂，只适用于体外研究


D2、病毒载体合成siRNA
1.siRNA在病毒骨架上进行转录，适用于原代细胞、可进行体内和体外实验；有可能进行稳定转染
2.使用腺病毒载体：可进行体内实验，转染效率高
3.使用逆转录病毒载体：可进行整合，导致稳定转染
4.构建过程复杂，成功率相对较低，而且具有安全隐患

E、PCR方法构建siRNA表达元件（SEC)
1.PCR方法构建含有特定启动子和终止子以及靶定DNA序列的表达元件
2.转染到胞内后，在启动子操纵下，siRNA表达
3.方法简单，无需构建载体；
4.适用于siRNA序列筛选，及载体克隆前启动子的筛选
5.不适用于长期研究

常用的发卡结构中Loop环的长度和序列

	化学合成	体外转录	核糖核酸酶消化dsRNA	SiRNA表达载体	PCR表达元件
需要条件	21-mer RNA片断	29-mer DNA 片断	转录模板 (200-800 bp侧翼含有T7 启动子)	55-60-mer DNA 片断	~50-mer DNA 片断
需要的时间	4天-2周	24 小时加上DNA 准备时间	1天加上转录模板准备时间	5天加上DNA 准备时间	~ 6小时加上DNA准备时间
工作量	少或无	中等	中等	高	中等
是否需要检测优化 siRNA 序列	需要	需要	需要	不需要	需要
可否进行标记（以分析转染效率和显微镜定位	可以	可以	可以	不可以	不可以
转染的容易程度	好	好	好	很容易	很容易
可否筛选（即抗生素筛选)	不可以	不可以	不可以	可以	不可以
可否用于长期研究	不	不	不	带有选择性标志则可以	不
能否大规模合成	可以	受限	受限	可以	受限
能否检测群体的转染效率	不	不	不	可以	不
每个基因需要的费用（不包括劳力）	高	中等	低	中等	中等