原位DNA和DNA分子杂交方法- 点击： 作者： 来源： 日期：2007-04-04 本站论坛
DNA探针在病毒的检测等领域中得到广泛的应用.
杂交时需先在高温80~95℃短时处理,使DNA探针及细胞内靶DNA变性,解离成单链,迅速置于冰上冷却.然后置于37~42℃杂交过夜.
(一)地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法
1组织切片的预处理
(1)固定:组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定,常规石蜡包埋,切片厚4~6 μm,粘
附于涂有粘附剂的玻片上,入烤箱60~80℃ 6~8 h,使切片更紧粘贴于玻片.
(2)脱蜡:二甲苯10 min×2,自100%乙醇Ⅰ和Ⅱ, 95%,90%,70%,50%,30%各5 min.入PBS(含5 mmol/L MgCl2,pH73~74) 5 min×2.
(3)入02 mmol/L HCl 20 min以去除蛋白.
(4)50℃ 2×SSC,含5 mmol/L EDTA溶液中30 min.
(5)蛋白酶K(1 μg/ml溶于01 mol/L PBS中),37℃ 20~25 min.
(6)02 mol/L甘氨酸液:室温10 min,中止蛋白酶反应.
(7)4%多聚甲醛(PBS新鲜配制),室温20 min.
(8)PBS/5 mmol/L MgCl2漂洗10 min×2.
(9)脱水,自低浓度到高浓度至无水乙醇各3 min,空气干燥.
2预杂交
封闭非特异性杂交位点,加预杂交液20 μl/每张切片,42℃水浴半小时.
3杂交
加杂交液10~20 μl/每张切片,加盖硅化盖片,将切片置于95℃ 10 min,使探针及病毒DNA
变性,然后迅速置于冰上1 min,再将切片置于盛有2×SSC湿盒内,42℃过夜(16~18 h).
4杂交后漂洗
(1)2×SSC液内振动移除盖片.
(2)2×SSC 55℃ 10 min×2.
(3)05×SSC 50℃ 5 min×2.
(4)缓冲液Ⅱ(含05%封阻试剂,用缓冲液Ⅰ溶解)37℃ 30 min.
(5)缓冲液Ⅰ(100 mmol/L TrisHCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,室温.
(6)酶标地高辛抗体(1:5 000,应用缓冲液Ⅰ解释)37℃ 30 min.
(7)缓冲液Ⅰ 15 min×2,室温.
(8)缓冲液Ⅲ(100 mmol/L TrisHCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室温,
2 min.
5显色
(1)显色液配制:在缓冲液Ⅲ 1 ml中加入45 μl四氮唑蓝(NBT),35 μl X磷酸盐(5溴4氯3吲哚磷酸盐(BCIP)配成.30 μl/每张切片,置暗处显色(30 min到2 h.定时抽查切片,镜检其显色情况.
(2)缓冲液Ⅳ(10 mmol/L TrisHCl,1 mmol/L EDTA,pH80) 10 min终止反应,用核固红或甲绿复染5 min,二甲苯透明,DPX封固,镜检.
6结果
杂交阳性信号呈紫兰色,细胞核呈红或绿色.
(二)生物素标记HPVDNA探针在石蜡切片上检测HPVDNA的方法.
1玻片的预处理
组织细胞原位核酸杂交主要在载玻片上进行,因此玻片的处理至关重要.载玻片(或盖玻片)
一般要经过1 mmol/L HCl溶液或重铬酸钾硫酸溶液的浸泡,取出后充分用自来水冲洗,用双
蒸水洗三遍,然后置于60℃烤箱中烤干.将烤干的玻片分别插在染色架中,置250℃烤箱
中烘烤4 h,目的是去除玻片上残留的核酸酶.
为了防止组织或细胞在杂交过程中脱落,原位核酸杂交所需的玻片必需进行硅化处理.把经
过250℃烘烤过的玻片用2% 3氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液处理玻片,有助于组织和载玻片的粘附.APES对甲醛固定的组织粘附效果好,可使组织与载玻片发生共价结合.
玻片硅化方法:(1)室温下将高温处理过的载玻片用2% APES丙酮液浸泡3 min;(2)用丙酮洗去多余的APES;(3)用DEPC处理的蒸馏水或高压消毒的蒸馏水清洗玻片1~2次;(4)40℃烤干玻片,防污保存在干燥器皿中待用.整个处理过程均要戴消毒手套进行操作.
2组织切片
常用的原位杂交标本有石蜡切片,冰冻切片和细胞培养标本.无论是哪一类的标本,在制备
时都要尽量避免RNase污染.操作时要戴手套,要用75%的酒精擦洗工作面和切片刀,镊子等.石蜡切片时,展片要用高压消毒处理过的蒸馏水,裱片后把切片
置60℃烤箱中烤片1~3 h.置室温下保存备用.新鲜组织切片最好先用固定剂固定(如用4%多聚甲醛或冷丙酮固定10 min),吹干后-70℃保存或在70%酒精中4℃保存,培养细胞标本的处理方法与冰冻切片法相似.
3杂交前处理
目的在于提高组织的通透性,以防止DNA探针与细胞,组织之间的非特异结合,以增强杂交
信号,减少背景着色.
(1)脱蜡
石蜡切片必需充分脱蜡,因为石蜡未脱净会影响探针的穿透力,因而脱蜡用的二甲苯尽
可能新鲜.常规石蜡切片用二甲苯脱蜡3次,每次5 min;脱蜡后用逐级梯度酒精(100%,95%,
90%,80%,70%)清洗,然后用蒸馏水洗3 min,必须用高压处理过的蒸馏水.
(2)蛋白酶处理
蛋白酶的消化能使固定后被遮掩的靶核酸暴露,以增加探针与靶核酸结合的机会.常用的蛋
白酶有蛋白酶K(proteinase K),链霉蛋白酶(pronase)和胃蛋白酶(pepsin),蛋白酶BP等.
蛋白酶的浓度及消化时间,视组织种类,固定类型,切片厚度而定,一般使用1 μg/ml蛋白酶K(用含50 mmol/L EDTA的pH80,01 mol/L TrisHCl缓冲液配制),也可用001%蛋白酶BP(用pH80 PE配制)37℃孵育10~30 min.蛋白酶具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用,促进探针渗透,从而提高杂交信号.但过度的蛋白酶消化会引起细胞形态结构的破坏及靶核酸的减少,也会导致标本从载玻片上的脱落.
4杂交反应
(1)变性和杂交
进行杂交反应时,探针和靶核酸都必须是单链.如果用双链cDNA探针检测,则探针和
靶核酸都必须先解链,也就是变性.将生物素标记的双链探针杂交液滴在待检组织上,然后加
盖经250℃高温处理过的盖玻片,勿产生气泡,并在盖玻片周边用石蜡油封边(目的是防止探针和杂交液在杂交过程中蒸发),将含有探针的载玻片放入已经加热煮沸(95~100℃)的水浴箱的密封盒中(容器底部预先加入适量的蒸馏水)变性5~10 min.探针和靶DNA同时变性,变性的单链探针与靶DNA随即进行杂交反应.如果用单链探针与靶DNA进行杂交,虽然探针本身并不需要变性,但也可将探针加在组织标本上,用上述方法使靶DNA变性.变性完毕将切片放在冰块上迅速降温1~2 min,然后将切片移入湿盒内置37℃培养箱杂交60 min.如有条件也可用原位杂交仪进行变性和杂交,先调整好原位杂交仪的变性,杂交时间和温度,将玻片放入杂交仪内进行变性杂交,当杂交仪升温至95℃时即可进行变性,变性后温度迅速下降到37℃时即可进行杂交反应.
(2)杂交后漂洗
其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,
降低背景染色,增加信/噪比.
将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出,用2×SSC将盖玻片洗脱,2×SSC 30℃洗2次,每次15 min;1×SSC 42℃洗2次,每次15 min;05×SSC 37℃洗2次,每次15 min,TBS缓冲液洗2次.注意在漂洗过程中切不要使切片干燥.
(3)杂交信号的检测
探针与靶核苷酸结合形成杂交体,对其检测的方法因探针的标记物不同而异,一般与免疫组化
方法类似,当带有酶的抗半抗原抗体(或者抗生物素蛋白)通过搭桥(或直接)与探针连接后,催化底物混合液中的底物发生反应,使其产生有色沉淀物即为阳性反应.现在大多数的研究都是采用碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶与抗半抗原抗体(或抗生物素蛋白)连接进行检测.在切片组织上滴加碱性磷酸酶标记的链菌素(streptavidin alkaline phosphatase conjugated)溶液,室温孵育20~40 min,TBS缓冲液洗3次×5 min,加入BCIP/NBT室温暗处显色10~30 min,TBS缓冲液洗,01%核固红复染切片5 min,蒸馏水冲洗,酒精脱水,中性树胶封片.
(4)杂交结果
DNA原位核酸分子杂交阳性反应为靶基因存在的部位,一般在细胞核内,呈紫蓝色颗粒状,若靶基因数量多或显色时间长,则整个细胞核呈浓染蓝色,阴性细胞核呈红色.
(5)对照试验
①阳性对照:用已知含靶核酸序列的组织作对照.
②阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照.
③用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布.
④省略标记探针.
⑤DNA酶消化靶DNA对照.
〖HJ1〗(6)非特异性染色
非特异性染色可能会来自探针,组织内源性酶,组织细胞,显色系统等;探针特异性不高以
及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色.组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤.如过氧化物酶用3% H2O2处理5~10 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色.NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色.必须根据检测系统不同
的标记酶作不同的内源酶处理. 上一篇：原位分子杂交技术的基本方法 下一篇：RNA原位核酸杂交方法－基本原理 |
