RNA原位核酸杂交方法－基本原理- 点击： 作者： 来源： 日期：2007-04-04 本站论坛
RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交组织化学(RNA in situ hybridization histochemistry)或RNA原位杂交[6,7,25] (RNA in situ hybri
dization RISH).该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内 RNA表达的一种原位杂交技术.其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA
核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂
交),所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相
应的mRNA,rRNA和tRNA分子.RNA原位杂交技术经不断改进,其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术.尤其在基因分析和诊断方面能作定性,定位和定量分析,已成为最有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向.RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有:(1)使用的探针不同:RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针,因此避免了应用双链DNA探针在杂交反应中存在的两条链之间的复性和第二条链的竞争性杂交问题.cRNA-RNA之间形成的杂交体要比DNA-DNA,cDNA-RNA杂交体性能稳定,在杂交反应后可用RNA酶洗脱,以除去未结合的探针,因此特异性更强.(2)检测的目的不同:RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因,包括细胞内固有基因,异常基因和变异基因.以正确反映组织与细胞之间相互关系及功能和代谢状态,探索疾病发病机理,观察治疗的疗效和评估疾病的预后等.其次为对外源性基因检测,以获得病毒和细菌类型等病原学诊断.而DNA原位杂交主要为外源性基因检测.(3)有较高的灵敏度:在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时,RNA原位杂交能获得较好定位,而DNA原位杂交则难以信任.但RNA原位杂交也存在某些不足之处,为使RNA原位杂交标准化和克服其不足之处必须注意以下几点:(1)不同探针种类的选择,制备和标记要适合靶核酸和组织的特点;(2)有效制止组织和细胞内RNA降解;(3)实验流程中严防RNA酶污染;(4)对杂交信号有效的放大和显色技巧;(5)阳性结果判别,不仅需要有阳性和阴性标本对照,有条件的更需要观测Northern杂交和免疫组化对同一组织的冰冻切片和石蜡切片中,基因及其产物两者表达之间联系.(6)在实验流程的各个技术环节中熟练运用技术控制是保证RNA原位杂交成功的必要条件.近几年来RNA原位杂交已得到稳步发展.主要表现在:非同位素标记的探针制备和标记技术的进步,杂交信号放大的应用,组织预处理的改进,RNA原位杂交和免疫组化双重检测技术和激光共聚焦显微镜在多重RNA原位杂交中应用等.从理论上讲,RNA原位杂交已趋成熟和完善,关键是在实际应用中能否被人们所受接并应用到各学科的研究中,促进人们对各类基因识别和表达规律的认识. 上一篇：原位DNA和DNA分子杂交方法 下一篇：RNA原位杂交中的探针 |
