cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交- 点击： 作者： 来源： 日期：2007-04-04 本站论坛
(一)组织的前处理
1. 冰冻切片的制备:(1)离体后组织应切成1.5×1.2cm,厚度为0.2cm.(2)立即投入4% 多
聚甲醛溶液中(PBS新配制),4℃ 下固定2-4小时.(3)倒去固定液后,加入30% 蔗糖溶液
(PBS新配制),4℃ 下过夜, 次日将组织块储存在-80℃ 或-140℃ 超低温冰箱内.(4)或
将组织块置于-20℃ 恒冷切片机内切成10μm薄片,粘附于涂有粘附剂的载玻片上置室温下
,置40℃ 恒温箱内过夜,或置40℃ 恒温箱内至少2小时,后将切片放入切片盒在-80℃ 超
低温冰箱内存放备用.
2. 组织的固定和石蜡切片的制备:(1)离体后组织切成不大于1.5× 1.2cm,厚0.2cm.(2)
立即投入4% 多聚甲醛溶液内(PBS新配制),或2.5% 戊二醛,在室温下固定3-4小时.(3)用PBS冲洗,经梯度酒精脱水,二甲苯透明和浸蜡包埋切片.(4)切成5μm薄片粘附于涂有粘附剂的载玻片上,在40℃ 恒温箱内过夜干燥切片,用新的二甲苯脱蜡2×10min和100%,95%,70%,各级酒精1×5min,ddH2O漂洗2×5min.
注意事项
(1)切除的新鲜标本应立即作组织固定或低温储存,以免mRNA降解.
(2)标本尽可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰冻切片,这一制备法既能避免mRNA降解,又
能保持良好的组织形态.
(3)对外检病例中,采用10% 福尔马林固定标本的,为利于mRNA检测,固定时间不要超过36小时,以免引起RNA与蛋白质之间发生交联.
(4)在冰冻切片和石蜡切片制作过程中,所使用的容器,器械都要经高压消毒,或清洁后用0
.1% DEPC水清洗,再经ddH2O冲洗,避免外源性RNA酶污染.
(二)RNA探针的标记
RNA探针的制备需将cDNA探针克隆到带有RNA多聚酶启动子的质粒,然后转录制成RNA探针.
用EDTA缓冲液和DEPC处理的ddH2O将会影响RNA多聚酶中的质粒.RNA探针的长度应500bp的探针不易与mRNA形成杂交体.对探针标记,预杂交,杂交和后杂交流程中使用的容器,ddH2O均需经0.1% DEPC处理,为避免RNA酶污染,操作人员必须戴手套和口罩操作.
RNA探针的纯化:①在杂交探针中加入5μl 10% 乙酸(acetic acicl),11μl 3mol/L醋酸
纳PH6.0,1μl 10mg/ml tRNA,1.2μl 1mol/L MgCl2,300μl 冷酒精.②在-20℃ 孵育4-
16小时.③在4℃ 下15min,使RNA发生沉淀.④真空下干燥RNA沉淀物.⑤用DEPC处理的ddH2O含标记的RNA探针10-50μg/ml.RNA探针的水解:按以下方法减少探针长度为近200bp,在Microcentrifuge 管内加入50μl RNA探针标记液,加入30μl 200mmol/L Na2CO3 和20μl 200mmol/L NaHCo3.将杂交探针置于60℃ 条件下,按以下方法计算水解时间,t =(L0-Lf)/ (K. LO. Lf) (L0 = RNA探针原长度(kb),Lf = RNA探针水解后所需长度,K = 常数率(K = 0.11kb/min),t =水解时间).
(三)预杂交
(1)切片用DEPC处理的PBS PH7.4(140mmol/L NaCl ,2.7mmol KCl,10mmol/L Na2HPO4, 1.8m
mol/L KH2PO4) 孵育2×5min,再用DEPC处理的含100mmol/L 苷氨酸(Glycine)PBS 孵育切片2×5min.(2)用DEPC处理的含0.3% Triton X-100 PBS孵育15min.(3)用DEPC处理的PBS漂洗2×5min.(4)冰冻切片用TE缓冲液(100mmol/L Tris-HCl ,50 mmol/L EDTA PH 8.0)不含RNA酶的1μg/ml蛋白酶K,在37℃ 下通透切片30 min.石蜡切片用TE缓冲液配制的不含RNA酶的5-20μg/ml蛋白酶K,在37℃ 下通透切片30min.(5)在4℃ 下用DEPC处理的4% 多聚甲醛PBS 溶液作后固定5min.(6)再用DEPC 处理的PBS冲洗切片2×5min.(7)切片作酸酐处理,处理液含0.25醋酸酐,0.1mol/L 三乙醇胺(Triethanolamine TEA)PH8.0,振荡漂洗2×5min.(8)在37℃ 孵育切片后,杂交缓冲液冲洗(含50% 去离子甲酰胺的4×SSC),至少10 min.
注意事项
(1)切片的通透化是RNA原位杂交关键步骤,特别对回顾性资料尤为重要,因固定液种类和固
定时间的不同,需作最佳通透化条件探索,包括蛋白酶K浓度,孵育时间20-30min之间调整
,甚至采用0.2mol/L HCL配制的0.1% 胃蛋白酶.
(2)由于醋酸酐极不稳定,宜将醋酸酐在使用前加到TEA缓冲液中.
(3)1×SSC = 150mmol/L NaCl,15mmol/L sodium citrate pH7.2.
(四)原位杂交
(1)杂交液 (40% 去离子甲酰胺,10% 葡聚糖,1×Denhardt's ,0.02% Ficoll,0.02%
聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone),10mg/ml去RNA 酶的牛血清,4×SSC,10mmol/L
DTT ,1mg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA)的准备.(2)沥干后用杂交缓冲液漂洗,并沿组织周
边擦干,每张切片滴加30μl探针杂交液(内含5-10ng非同位素标记cRNA探针).(3)用24×30mm杂交罩(hydrophobic plastic coverslip)复盖杂交组织.(4)置42℃ 湿盒内过夜.
注意事项:杂交液应新配制,并在-20℃ 下储存,新配制杂交液能使用几个月.
(五)杂交后处理
(1)揭去杂交罩将切片浸泡于2×SSC中5 - 10min.(2) 在37℃ 用 2×SSC 2×15min,1×SSC 2×15min振荡漂洗.(3)为消除未杂交单股cRNA探针,在37℃ 含RNA酶A 的NTE缓冲液(500mmol/L NaCl,10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,PH8.0)中漂洗30min.(4)置37℃ 用0.1×SSC振荡漂洗2×30min.
注意事项
在同一容器中不能同时放入含不同探针切片.(2)如果杂交的背景较高,非特异性信号较多,可采用52℃ 含5% 甲酰胺的2×SSC洗脱.
(六)杂交后显色
(1)用Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-Hcl,150mmol/L NaCl)振荡漂洗切片2×10min.(2)
每张切片滴加封闭液40μl (含0.1% Triton X-100和2% 正常羊血清的Buffer A PH7.5).(3)抖去封闭液,每张切片加羊抗地高辛抗体AKP结合物30μl (Buffer A内含0.1% Triton X-100,1% 正常羊血清, 羊抗地高辛抗体AKP结合物)在温盒内2小时.(4)用Buffer A振荡漂洗切片2×10min.(5)用Buffer B PH9.5(100mmol/L Tris-Hcl,100mmol/L NaCl,50mmol/L MgCl2 )孵育切片10 min.(6)显色液配制:用10ml Buffer B PH9.5,内含45μl 硝基四氮唑蓝(Nitroblue tetrazolium NBT)(75mg/ml NBT,70%二甲基甲酰胺),35μl 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate BCIP)或X - Phosphate(50mg X - Phosphate/ml,100%二甲基甲酰胺).(7) 每张切片200μl显色液,在黑暗条件下显色2-24小时.(8)显色满意后用Buffer C PH8.1(10mmol/L Tris-Hcl,1mmol/L EDTA) 冲洗漂洗切片.(9)ddH2O中止反应.(10)用0.02% 亮绿或0.1% 核固红复染细胞核1-2min.(11)用自来水洗2×10min.(12)用即用型(Gva Mount)水溶性封片剂封片.
注意事项
(1)显色液的配制:10ml Buffer B PH9.5溶液中含有45μl NBT(70% 二甲基甲酰胺中含有75mg/1ml NBT),35μl BCIP或X-磷酸盐(100% 二甲基甲酰胺中含有50mg/ml X-磷酸盐)
,1mmol/L左旋咪唑(levamisole)(2.4mg/10ml左旋咪唑 Sigma).
(2)抗地高辛抗体-AKP的最佳浓度探索可采用同一杂交切片,用1:100,1:500和1:1000抗体浓度比较之.
(3)如果显色液中用1mmol/L左旋咪唑的浓度,仍然发现内源性磷酸脂的活性较高(背景色)
,左旋咪唑的浓度可以增加到5mmol/L.
(4)NBT/BCIP显色液后杂交切片,不能用二甲苯透明和溶二甲苯的封片剂.
(5)滴加杂交液和显色液应防止流失,除标记切片放平整之外,很重要的原因之一与载玻片
的清洁度有关.用DAKO魔笔沿组织周围划圈,在杂交反应中既可省略杂交罩,又可在显色反
应中防止反应液外溢.
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