)预杂交
1. 将DEPC处理的切片经ddH2O漂洗 2×5min.
2. 准备杂交液(3×SSC,1×Denhard's液(0.02%(W/V) Ficoll,0.02%(W/V) 小牛血清 ,0.
02%(W/V) 聚乙烯吡咯烷酮( polyvinylpyrrolidone),10% (W/V)葡聚糖,125μg/ml 酵母t
RNA,100μg/ml变性和剪切的硅鱼精子DNA,10μg/ml Polyadenylcytidyic acid,50% 甲
酰胺, 20mmol/L 焦磷酸纳 PH7.2).
3. 按组织片大小, 每张切片滴加40μl杂交液,置37℃ 温盒内2小时.
(五)杂交
抖去甩干杂交溶液,用DAKO魔笔沿组织周围划圈,滴加30μl 探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针),在44℃ 湿盒内孵育过夜.
注意事项
1. 寡核苷酸探针杂交条件,既要保证杂交特异性的严格性,又要具有能在适当速率下形成
稳定杂交体的松动性.一般情况下,用合成寡核苷酸进行杂交的条件要比杂交体的解链温度
(Tm)值降低5-10℃.这一条件可以减少短探针杂交可能造成假阳性的碱基错配,也会使完
全配对的杂交体形成速率降低.短寡核苷酸与靶序列形成的杂交体极易解体,杂交后漂洗必
须尽快进行.
2. 在使用靶序列完全配对的单一寡核苷酸探针时,杂交条件极易从杂交体的Tm值推得.对
短于18个核苷酸的寡核苷酸 上一篇：cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交 下一篇：用cDNA探针检测体外培养细胞中的RNA原位杂交
共5页: 上一页 [1] 2 [3] [4] [5] 下一页
