(一)细胞的准备,固定和细胞的通透
1. 在37℃ 5%CO2大气压下,用涂有多聚左旋赖氨酸的显微载玻片上培养细胞.
2. 用37℃ 0.01mol/L PH7.4 PBS漂洗细胞,用福尔马林醋酸固定液 (用0.9% NaCl 配制,
内含4% 甲醛,5% 醋酸)常温下固定30min.
3. 常温下用0.01mol/L PH7.4 PBC冲洗已固定细胞片,然后将细胞片储存在4℃,70% 酒精
内.
4. 杂交前处理,按70%,90% 和100% 各级酒精梯度脱水,用二甲苯洗脱细胞片中残留脂滴
,再由高浓度酒精至低浓度酒精(100%,90% 和70%)依次至ddH2O,然后用0.01mol/L PH7.4
PBS孵育细胞片.
5. 干燥细胞片后,在37℃ 湿盒内用0.1% 胃蛋白酶(用0.1N HCl配制)通透细胞片 20min.
注意事项
为有效防止外源性RNA酶的污染,显微载玻片,盖玻片和培养皿分别参考有关要求作:浸泡
,清洗,干燥和用铝箔纸包裹后烘烤灭RNA酶处理.
(二)原位杂交
1. 选用适合DNA标记的地高辛等标记物,并参考地高辛标记手册.
2. 准备杂交液(60% 去离子甲酰胺,300mmol/L NaCl,30mmol/L柠檬酸钠,10mmol/L EDTA
,25mmol/L NaH2PO4(PH7.4),5%葡聚酸和 250ng/μl剪切的鲑鱼精子DNA.
3. 在杂交前将标记的cDNA探针在80℃ 中短暂复性,然后加入杂交液,其浓度为5ng/ml.
4. 滴加10μl杂交混合液(杂交液加探针)于细胞片,置37℃ 湿盒内杂交16小时.
(三)杂交后洗脱
1. 杂交后在常温下,用60% 甲酰胺,300mmol/L NaCl和30mmol/L 柠檬钠,冲洗漂洗细胞
片.
2. 用37℃ 上述溶液振荡漂洗细胞片3×1min.
3. 用0.01mol/L PH7.4 PBS 漂洗细胞片1×5min.
(四)免疫荧光检测
1. 滴加封闭缓冲液(100mmol/L Tris-HCl PH7.5,150mmol/L NaCl,2% BSA) 置37℃ 湿盒
内30min,以封闭非特异性结合部位.
2. 沥干细胞片,滴加抗地高辛抗体(1:200,1:500用封闭缓冲液配制) 在37℃ 内45 min.
3. 用Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,0.05% Tween 20) 冲洗漂洗
各5min.
4. 由低浓度至高浓度(70%,90%,100%)各级酒精梯度脱水各5min.
5. 空气中干燥细胞片.
6. 滴加甘油显色混合液.
注意事项
甘油显色混合液的配制:9份甘油比1份(1mol/L Tris-HCl(PH7.5), 2% 1.4-diaza-bicyclo
-[2.2.2]-octane (DABCO)和DNA复染剂(或碘化丙啶Propidium iodide PI 500ng/ml)或 DAP
I (75ng/ml)
7. 在荧光显微镜下观察
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