原位杂交(In situ Hybridization )
- 点击： 作者： 来源： 日期：2007-12-20 本站论坛
3． 0.1M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1M PBS，定容至100ml，高压灭菌。
4． 4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddH2O 400ml，加热至70℃左右，用1M NaOH调pH至7.0，用ddH2O定容至500ml，再加0.2M PB 500ml，总体积为1000ml。
5． 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4g、聚蔗糖0.4g，加dd H2O至10ml，无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。
6． 预杂交液：去离子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2ml、1M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2ml、5M NaCl 1.2ml、0.5M EDTA(pH 8.0) 0.04ml、0.1M二硫苏糖醇 2 ml、ddH2O 2.21ml，总体积为10ml。无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。临用前加入50mg/ml变性鲑鱼精DNA 75μl/ml。
7． 20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加水至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。
8． 抗体稀释液：Triton X-100 80μl、BSA 0.2g，以0.05M PBS定容至20ml。
9． TSM1：1M Tris-HCl(pH 8.0)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O 100ml。
TSM2（新鲜配制）：1M Tris-HCl(pH 9.5)10ml、5M NaCl 2ml、1M MgCl2 1ml，加ddH2O至100ml。
显色液（临用前现配）：5ml TSM2 加显色液原液（NBT/BCIP）150μl，并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24μg/ml，避光。
三、操作步骤
（一）取材、冰冻切片：
将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（见图2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。将组织块入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。
（二）探针制备与检测（定量）：
1．随机引物制备cDNA核酸探针
以DIG DNA 标记检测试剂盒为例：
（1）探针制备：
①模板DNA(0.5-3μg) 15μl，100℃变性10min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2μl, dNTPmix 2μl, Klenow Enzyme 1μl，反应总体积为20μl。37℃孵育过夜。
③在上述20μl的标记产物中加4M LiCl 2.5μl, 75μl（无水乙醇预冷）,轻轻混匀，-20℃放置 2hr。4℃离心12000g×15min，弃上清。70%乙醇(预冷) 50μl洗涤，7500g×5min，弃上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解沉淀，-20℃保存备用。
（2）探针敏感性检测：
①样品稀释：取dig-标记探针1μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀释。
②取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH2O中浸泡 1min，6×SSC中浸泡10min，置点样器上，负压抽吸5min。
③将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10min。
④取下尼龙膜，置紫外灯下10cm处照射5min，晾干。
