原位杂交(In situ Hybridization )-试验方案

5-10 ml）中，37℃预杂交10min。

⑥加入Anti-dig 抗体（1:5000），37℃杂交30min。

⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10 min×2次。

⑧显色：15 mlTSM₂中加300μl显色液（NBT/BCIP），37℃避光显色30min。

1． PCR法制备cDNA核酸探针：

（１）探针制备：

以PCR DIG Probe Synthesis Kit 为例：

在0.5ml离心管中，依次加入：

PCR 引物 1（10pM） 2μl

质粒DNA 模板（10-100pg） 2μl

PCR DIG mix 2μl

(含dNTP和DIG-11-dUTP)

dNTPmix 2μl

10×PCR buffer 5μl

Taq 酶（2u/μl） 1μl

加入适量ddH₂O，使总体积达50μl。

① 将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 45s → 58℃ 45s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。

② 在上述PCR产物中加入4M LiCl 12.5μl、预冷无水乙醇375μl，轻轻混合后置于-20℃2hr, 12,000g×15min，弃上清。70%乙醇(预冷) 120μl洗涤沉淀，离心7500g×5min，弃上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解,-20℃保存备用。

（2）探针检测：

行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量（采用目测法）。

（三）原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：

1．0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。

2．0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。

3．0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。

4．0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。

5． 4%多聚甲醛浸5min。

6． 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。

7．预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。

1．杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃ 过夜。（阴性对照