原位杂交(In situ Hybridization )
- 点击： 作者： 来源： 日期：2007-12-20 本站论坛
2． 洗片：
(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；
0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；
0.05M PBS 洗 5min×2次。
10．3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
11． 滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀
释）4℃孵育过夜。
12． 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min×2次。
13． 显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。
14． 将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。
15．显微镜下观察结果。
（四）免疫组化和原位杂交双重染色
1．免疫组化：
（1）将切片浸没于100ml甲醇溶液中（含20μl H2O2），5min。
（2）0.01M PBS洗3min×3次，加入含0.25% Trion X-100的0.01M PBS，5min。
（3）0.01M PBS洗3min×3次，加入1%BSA包被液，37℃ 30min。
（4）0.01M PBS洗3min×3次，滴加适当稀释的一抗，4℃过夜。阴性对照组除不加一抗外，其余步骤相同。
（5）0.01M PBS洗3min×3次，滴加适当稀释的二抗（辣根过氧化酶标记），室温放置1-2hr。
（6）0.01M PBS洗3min×3次，0.03%DAB/0.02% H2O2 呈色3-5min。（阳性信号呈棕黄色）
（7）用H2O2轻轻洗涤切片，以终止反应。
2．原位杂交：
免疫组化反应结束后，切片即进入原位杂交的第（4）步，直至结束。（原位杂交阳性信号呈兰紫色）。
四、注意事项：
１． 作为DNA-RNA的杂交，需防RNase的污染。
cDNA探针在杂交时必须变性解链。具体方法是：将探针置100℃加热5min，冰浴骤冷。
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