简介
细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫应答。细胞因子是具有效应及调节双重作用的独特蛋白。近来研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－g)与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
胞内流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。此分析采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。
检测方法
图一显示了该方法主要步骤。
尽管方法简单快速，免疫功能检测要求激活过程与激活剂仔细制备、储存与使用，因此该方法包括了BD研究组特殊推荐的激活步骤。成功地激活对得到可信的结果非常重要，因此在细胞收集与制备过程中必须排除可能干扰正常激活过程的因素。避免使用络合钙的抗凝剂ACD与EDTA，因为它会限制钙依赖性激活过程，此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。我们建议完全依照此方法，首先从正常血样分析开始，再进行异常样本的分析或更改试验条件。
一、 仪器设备
1．12×75mm有盖的Falcon管(BD Catalog No.2058)
2．37℃孵箱7%CO2
3．混匀振荡器
4．离心机
5．加样器、Tips
6．FACS流式细胞仪
二、 细胞
1、全血
使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管(BD VACUTAINER Catalog No.367673), FastIMMUNE 不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
2、自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)
使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管(CPTs)(BD VACUTAINER Catalog No.362753)24小时内分析。
3、组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)
用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2×106细胞/mL于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640。
4、细胞系与T细胞克隆
调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
5、冰冻全血与PBMCs
应用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS，冻存－70℃。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS通透液通透与染色。
三、 选择、制备、储存试剂
激活剂(BD 不提供)
1．Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Cataog No.P-8139)
a. 于DMSO中调节浓度0.1mg/mL
b. 分装(20mL)，－20℃储存。勿反复冻融
c. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液
d. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液。
2．Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)
a. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL
b. －20℃储存。
c. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
d. Ionomycin终浓度1mg/mL细胞悬液。
3．Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (sigma Catalog No.S-4881)
a. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL
b. 4℃储存。
c. SEB终浓度10mg/mL细胞悬液。
4．Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651)
a. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
b. 分装(20mL)，－20℃储存。勿反复冻融。
c. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
d. 激活最后4－5小时BFA终浓度10mg/mL细胞悬液。
注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降。
5．不含谷氨酰胺的RPMI-1640
6．无菌无叠氮钠PBS
7．DMSO(sigma Catalog No.D－8779)
8．乙醇
9．洗液，含0.5%BSA与0.1%NaN3 , 4℃储存。
10．含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
11.细胞表面染色的标记荧光单抗试剂
依据实验需要选择特殊表面标志
CD45-PerCP圈定所有淋巴细胞
CD3-PerCP圈定T淋巴细胞
CD4-PerCP或CD8-PerCP圈定特定T淋巴细胞亚群
CD19-PerCP或CD20-PerCP圈定B淋巴细胞
CD56-PerCP圈定NK淋巴细胞
CD14-PerCP圈定单核细胞
12.FACS溶血素
FACS溶血素(BDIS Catalog No.349202)用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主要有3个作用：
1、全血制备时用于溶解红细胞
2、固定外表位
3、辅助通透剂
FACS溶血素使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。
13.FACS通透液
BD推出FACS通透液(BDIS Catalog No.340457)以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足。(由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异)FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。
FACS通透液使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。
14．细胞内染色的标记荧光单抗试剂
依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记IFNg-FITC/IL-4PE与CD3PerCP组合是同时研究TH1与TH2型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用BFA等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。BD在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。
四、 激活
激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含BFA。激活过程在有盖的Falcon管中进行，所有试剂浓度都为在激活混合物中的终浓度。
1、 PMA+inonmycin(PMA+I)
a．全血或PBMCs用无血清的RPMI1640 1：1稀释(此稀释只适用PMA+I激活，细胞浓度2×106/mL则无须稀释)
b．25ng/mL PMA(25mL工作液/mL全血)，1mg/mL inonmycin(20mL工作液/mL全血)，10mg/mLBFA(20mL工作液/mL全血)共刺激
c．37℃，7%CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖，可控制PH值；若用水浴需旋紧盖子。)
2、 SEB
a．未稀释血用10mg/mLSEB与10mg/mL BFA刺激
b．37℃，7%CO2 ，4~6小时孵育
3、 CD2/CD2R(BDIS Cat.No.340366)
a.未稀释血用20mg/mL CD2/CD2R与10mg/mL BFA刺激
b.37℃，7%CO2 ，4~6小时孵育
4、 CD3
a.稀释血用CD3与10mg/mL BFA刺激
b.37℃，7%CO2 ，4~6小时孵育。建议使用CD5PerCP或CD45PerCP作FL3标记，因为CD3抗原因与CD3交联而减弱。
注意：此CD3为高浓度低叠氮钠CD3，不同于常用CD3，需特殊定货。
5、 CD28
用10mg/mL CD28(BDIS Cat.No.550017)可以增强CD3、CD2/CD2R、SEB等激活效应。
五、对照
正确的系统对照可以减小误差。在您修改此操作程序前，我们希望您先熟练操作此程序检测正常人血样。首先，用正常人血样制备以下对照，当您确认结果正确时，可以省略激活对照与胞内染色对照，但是您每次实验都需要做未刺激与同型对照。
1、 未刺激对照
未刺激对照用于评价体外激活过程中生成的细胞因子水平。血样与10mg/mLBFA共孵育，不加刺激剂。
2、 同型对照
同型对照用于检测细胞与抗体非特异结合所至非特异染色。所选用的抗-KLH同型对照专为胞内检测设计，省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
3、 激活对照
激活对照使用细胞表面表达CD69 来评价激活与否。如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
a.取部分血样加PMA+I但是不加BFA(抑分泌试剂如BFA会影响CD69表达，需去除以进行表面标志检测)。
b.表面染色CD69PE/CD3PerCP，省略通透与胞内染色步骤。
c.以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，表面CD69染色阳性率应在90%以上。
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4、 胞内染色对照
胞内染色对照通过胞内CD69染色与激活对照结果比较来评价通透与胞内染色是否正确进行。如果激活对照阳性率大于90%而胞内CD69未达到相应水平则通透与胞内染色步骤出了问题，确定你是否严格按照操作步骤进行实验，重新开始实验。
a.取部分血样加PMA+I+BFA
b.省略表面染色，胞内染色CD69PE/CD3PerCP(BDIS Cat.No.340368)
c.以FL3 设阈值CD3设门检测CD69，胞内CD69染色阳性率应在90%以上。
六、染色
抗细胞因子抗体可以与细胞表面标志抗体联用以研究不同细胞亚群。CD3PerCP，CD4FITC，CD8FITC是BDIS研究T淋巴细胞亚群时最常用的组合。多数受试者的CD4，CD14，CD56抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调, 所以不适于PMA激活血样的亚群分析。通透后同时加入所有荧光标记抗体以便所有表位同时着色。表面染色试剂做胞内染色时需重新调试滴度以得到最佳结果。表面标志的胞内染色需与表面染色结果比较确定是否相当。CD3，CD4，CD8抗原既可在通透前表面染色也可在通透后胞内染色，但这并不适用于所有抗原，因为其表位对多聚甲醛敏感性不同。
表面染色
1、加BDIS表面染色试剂20mL于Falcon管中
2、加100mL 稀释的PMA+I激活的全血或50mL未稀释全血(其他方式激活)于表面染色试剂中(用无血清的RPMI1640 1：1稀释的全血或PBMCs只适用PMA+I激活，细胞浓度2×106/mL则无须稀释)
3、混匀，室温暗处孵育15分钟
通透与胞内染色
1、加2mL 1×FACS 溶血素，室温暗处孵育10分钟。PBMCs或培养细胞染色时，加入FACS 溶血素可以固定表面表位，优化通透过程。
注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。
2、离心500g 5分钟，弃上清，加500mL 1×FACS通透剂室温暗处孵育10分钟。
3、加2~3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清。
4、加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。
5、加2~3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500mL 1% PFA。
注意：样本上机分析前可以在4℃避光放置24小时。
七、分析
1、应用BD FACS流式细胞仪分析。
2、使用CaliBRITE标准微球，FACSComp(1.1版本以上)软件调节流式细胞仪PMT电压，荧光补偿，灵敏度。
3、用CellQuest获取，用荧光或FSC设阈值，一般门内收集10，000细胞。
4、设门圈定FL3+细胞。以双色点图显示细胞因子的表达。可以用CellQuest，Attractors分析数据。PMA激活时，血小板可能会被圈在FL3门内，此时可以用FSC/SSC设门。以CD4设阈值时，以FSC/SSC设门可以排除单核细胞。
特异性结果的计算
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公式： |
(AS-AIC)-(US-UIC) |
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AS： 激活样本 |
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AIC：激活同型对照 |
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US：未刺激样本 |
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UIC：未刺激同型对照 |
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问题及解答
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问题 |
原因 |
解决 |
注释 |
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无CD69胞内染色 |
细胞未激活 |
激活剂制备不当，见激活剂制备储存一节。 |
PMA+I激活后4小时CD3+T淋巴细胞CD60阳性率应>90% |
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使用了错误的抗凝剂 |
只使用肝素钠，不要使用肝素锂，避免使用ACD与EDTA等络合钙的抗凝剂。 |
淋巴细胞激活需要Ca，络合Ca的抗凝剂会影响激活。 |
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细胞未通透 |
在使用FACS通透液前先使用FACS溶血素 |
FACS溶血素辅助细胞通透 |
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BFA失活或制备不当 |
详见BFA制备BFA于-20℃储存 |
详见BFA制备 |
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胞内染色阳性但很弱 |
抗细胞因子抗体浓度不对 |
按BD推荐量使用荧光抗体 |
正常的激活T淋巴细胞IL-4表达通常<2% |
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通透后细胞在胞内染色前未洗 |
按操作程序通透后洗细胞在胞内染色 |
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背景染色太高 |
荧光单抗不纯或荧光与抗体结合不牢导致解析出的荧光染料非特异结合 |
使用BDIS FastIMMUNE试剂 |
BDIS胞内同型对照专为胞内染色设计，配方与表面染色不同，可显著降低背景染色。胞内染色使用表面染色对照会导致高背景。 |
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抗体与固定后的胞内抗原亲和力低，需提高抗体浓度。 |
使用BDIS FastIMMUNE试剂 |
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错误的同型对照，对照Ig浓度过高 |
按BD推荐量使用BDIS匹配的同型对照试剂 |
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严重的细胞损失 |
洗涤离心步骤丢失细胞 |
固定通透的细胞离心500g |
固定后细胞密度低于活细胞，需用高转速离心。 |
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加样步骤都市细胞 |
弃上清，不用真空吸样器 |
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溶血不完全 |
PMA+I激活 |
按操作步骤用FL3做阈值去除岁片和未溶细胞 |
PMA可稳定红细胞膜，PMA+I激活全血较难溶 |
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FACS溶血素或通透剂未用无离子水1：10稀释 |
按操作步骤用无离子水1：10稀释FACS溶血素或通透剂 |
FACS溶血素或通透剂必须用无离子水1：10稀释，用PBS会影响渗透性。此操作步骤不适用于其他通透剂。 |
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溶血未在室温进行 |
在室温进行溶血 |
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