| 真核细胞表达系统 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-11-10 本站论坛 |
|  | 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就 。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：
①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制；
②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；
③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
1．酵母表达系统
最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。
甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1)，在该基因的启动子(PAXOI)作用下，外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli／Pichia Pastoris的穿梭载体，其中含有E.coli复制起点和筛选标志，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增.目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。
利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替PAXOI，不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。
2．昆虫细胞表达系统
杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。在AcNPV感染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码产生多角体蛋白，该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因的传递质粒与野生型 AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细胞中不能形成包涵体，利用这一特点可挑选 出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低，且载体构建时间长，一般需要4～6周。此外，昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。
在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，胞质内的物质释放出来，与 目的蛋白混在一起，从而使蛋白的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难，科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列：(1)Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子；（2）Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(编码俄IE-1蛋白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活肌动蛋白基因启动子)；(3) BmNPV的同源重复序列3(HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。三者协同作用，可使转录活性提高 1000倍以上，从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒由AcNPV及 Bni'qP发展而来。
一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个问题将Hsp70(热休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，暴露出疏水残基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚，这对最终的表达水平有很大影响。而Hsp70是一种分子伴侣，能够与新翻译的多肽结合，抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工，从而提高蛋白的分泌水平。
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