本篇中主要介绍生化方法及物理方法(电穿孔法) 1.生化方法 (1)磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 1)转染前24 h,通过胰酶消化收集细胞,用适当的完全培养基以1105至4105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm组织培养皿或12孔板上。于含5%~7% CO2的37℃温箱孵育20~24 h
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  • 真核细胞表达外源基因技术

  • 点击:    作者:   来源: 日期:2007-11-10    本站论坛

       10)如要获得稳定转化体,直接进行第11步。如果是瞬时表达,则于电穿孔24~96 h后用下述方法之一检测细胞:
       *如果使用的是表达E.coli β-半乳糖苷酶的质粒DNA,检测细胞裂解液中酶活性。
       *如果使用绿色荧光蛋白表达载体,在450~490 nm光照下用显微镜检测细胞。
       *如果使用其它基因产物,则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
       11)分离稳定转染体:用完全培养基培养48~72 h后,胰酶消化细胞,用适当的选择性培养基重铺细胞。每2~4天换液一次,持续2~3周,目的是去除死细胞残骸,并允许抗性细胞克隆生长。此后,克隆、繁殖独立克隆以用于检测[方法见Jakoby and Pastan 1979 或Spector et al. 1998b (《细胞试验手册》的第86章)]。

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