在基因功能研究过程中，常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达（transient expression），以流式细胞仪检测细胞周期的变化，观察转基因对细胞增殖的影响。由于各种转基因方法的不同，转基因的效率也不同，往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因，没有转基因的细胞将影响检测的结果。如何将已经转基因的细胞同未转基因的细胞区分开来进行检测，是一个技术上的难点。一种最直接的方法采用目的基因表达蛋白的抗体直接标记表达目的基因的细胞，条件是该目的基因必须是细胞内特异的，且表达的蛋白位于细胞膜。另外一种方法就是采用双基因共转染方法，常用的共转染基因有B或T淋巴细胞的分化抗原，如：CD19、CD20等[1]。由于这些基因特异的表达于B或T淋巴细胞，对靶细胞的功能影响极小，而且表达抗原位于细胞膜上，采用商品化的荧光标记抗体进行检测，比较容易。但是，采用商品化的抗体造成检测成本较高，且胰酶消化过程会破坏贴壁生长靶细胞的表面抗原，影响抗体标记。另外，在细胞周期处理过程中采用乙醇固定细胞也会造成一定的细胞表面分子的丢失。目前常用的一种方法就是将表达绿色荧光蛋白的质粒和目的基因共转染[2]；在共转染时，加入目的基因表达质粒的量远高于表达GFP质粒的量，以保证表达GFP基因的细胞能够表达目的基因。由于普通的GFP是表达于细胞胞浆内，在细胞周期检测过程中进行乙醇固定时，GFP会从胞内泄漏，造成无法区分转基因细胞和阴性细胞。解决的方法是在GFP蛋白的末端加入膜定位信号，使GFP定位表达于细胞膜或胞内膜上，这样可以大大减少处理过程中GFP的泄漏、丢失，从而可以有效地
上一篇：怎样研究植物抗病反应的分子机理 下一篇：流式细胞术检测凋亡的技术问题和常见问题解答
共10页: 上一页 1 [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] 下一页
