在基因功能研究过程中,常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达( transient expression ),以流式细胞仪检测细胞周期的变化,观察转基因对细胞增殖的影响。由于各种转基因方法的不同,转基因的效率也不同,往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因
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  • 表达EGFP的质粒和目的基因共转染用于检测目的基因对细胞周期的影响

  • 点击:    作者:   来源: 日期:2007-12-17    本站论坛

 pSP72质粒购自Promega公司。pEGFPN-1购自Clontech公司,pBB14pCMVEGFPspectrin、均由Kalejta RF惠赠。所有表达绿色荧光蛋白的表达载体所采用的绿色荧光蛋白均是经过筛选的适合流式标记过程的突变体。pBB14质粒表达伪狂犬病毒野生型蛋白Us9EGFP的融和蛋白(Us9-EGFP),由于含有Us9蛋白,可以定位表达于胞浆内膜、高尔基体、胞浆囊泡等部位[3,4]pCMVEGFPspectrin基因内含有人定形素(spectrin)的PH(Pleckstrin Homology)结构域,可以使GFP定位表达于胞浆内的膜上。

1.3 细胞处理和流式细胞仪检测

1.3.1 观察75%乙醇固定对细胞绿色荧光蛋白的影响。在转基因后48小时,以0.25%胰酶消化处理细胞,离心收集细胞后,以PBS重悬细胞,浓度为10

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