4，于室温脱菌培养并诱导分裂。原生质体细胞分裂至10 个细胞期时，逐渐降低培养基中的渗透压至原始培养基的一半。
6 ．选择培养：离心收集小细胞团及微小的愈伤组织，转至含有100～200ug/mL 卡那霉素和
500ug/mL 的羧苄青霉素的诱导愈伤组织或芽再生选择培养基上，进一步培养。
说明：
(1) 原生质体与农杆菌共培养转化具有如下优点：① 转化体来自单个细胞，便于对转化体进行T-DNA 整合及表达的分析，对转化体的分子生物学研究具有重要价值。② 转化频率一般在0.1％～1％，条件适宜时可高达20％。③ 一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。
(2) 原生质体的预培养是实验的一个关键。游离的原生质体在适宜的条件下形成细胞壁，然后进行分裂。将分裂之前刚形成新壁的细胞与农杆菌共培养，就能够成功地转化，在形成新壁之前及经多天培养之后都不易被转化。这很可能是因为转化与原生质体新壁的成分有关。对于不同的植物材料，需进行预备实验，摸索原生质体至细胞第一次分裂前所需的时间，烟草需1～2 天。
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