| 将细菌培养物或含菌标本材料制备的染色标本片，置显微镜油镜头下，可以观察到细菌的形状、大小、结构、排列及染色特性等，了解这些特征有助于鉴别各种细菌。
一、显微镜油镜头的使用与保护
【使用原理】
用油镜观察标本、是在使用高倍镜的基础上，采用同玻璃折光率相似的油状物（如香柏油、液体石腊等），滴加在标本与油镜头中间，以避免光线散射，提高显微镜的清晰度和分辨能力。使观察物象更加清楚明了。
【操作方法】
1. 调试：打开电源，先采用低倍镜，使视野达到清晰光亮。
2. 加油：双手向上转动粗螺旋，使镜筒上升，将标本片固定于载物台上，使染色面对准集光器央，加镜油于标本面，调换油镜头对准标本面。
3. 调焦点：用左手向下轻转粗螺旋，使镜筒下降，同时眼睛从右侧观察下降程度，待镜头入油后接触上玻片，用眼观目镜，反转粗螺旋，使镜筒慢慢上升，待看到模糊物象时，改用细螺旋上下调节，使物像达到完全清晰为宜（一般转动细调节前后半圈）。
4. 观察：观察时只使用细调。需改换视野时，右手操纵推进器，左手转动细螺旋，做到配合自如。并养成左眼观察，右眼绘图的习惯。
【油镜头的保护】
油镜头使用完结后，必须用擦镜纸滴加少量二甲苯将油擦洗干净（二甲苯用量宜少，以免镜片间粘胶溶解）。下降集光器，半接物镜转成“八”字，再下降镜筒，轻触镜台表面，双手平持显微放入镜箱，避免直射日光，置于干燥处，以防受潮。
【注意事项】
1. 使用直筒显微镜观察标本时，必须两眼同时睁开，训练使用左眼观察，右眼绘图。如用油镜头观察，勿将镜身歪斜，避免镜油流出片面。
2. 观察染色标本时，光线宜强，可上升集光器，开大光圈。观察不染色标本时，光源宜弱，可下降集光器，缩小光圈。
3. 使用完毕，一定擦去镜油。
二、细菌不染色标本
不染色的细菌和标本镜检，虽可观察细菌在自然生活状态下的大小、形态、活动等，但主要用于观察细菌的动力。
（一）悬滴法
【材料】
1. 细菌：枯草杆菌8~12小时肉汤培养物。
2. 凹玻片，盖玻片，凡士林等。
【方法】
1. 取凹玻片一张，于凹窝周围涂少许凡士林（见图1）。
2. 用接种环沾取枯草杆菌8~12小时培养物，置于盖玻片中央。
3. 反转凹玻片，使凹窝对准盖玻片中央，盖于其上，轻压后，迅速翻转玻片，使盖破片面向上。
4. 标本片置于显微镜载物台上，先用弱光线，低倍镜找物象，再改换高倍镜观察，密切注意，勿压破盖玻片。
5. 观察：细菌在镜下为灰色半透明体，并呈现真运动，如在明亮的海洋中，深入浅出游来动去。
（二）压滴法
用途同悬滴法。
【材料】
1. 细菌：枯草杆菌8~12小时肉汤培养物。
2. 载物玻片：盖玻片等。
【方法】
1. 取无油污物玻片1张。
2. 用接种环沾取枯草杆菌8~12小时肉汤培养物置于载物玻片中央。
3. 加盖玻片于菌液表面，观察方法同悬滴法。
三、细菌染色标本片的制备（操作）
由于细菌个体微小，基本上无色透明，故将其用适当染料染色观察，方能显示它的形态、大小、构造及染色特性等，在细菌和鉴别上有重要意义。
【材料】
1. 葡萄球菌 大肠杆菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。
2. 革兰染色液。
3. 生理盐水，载物玻片，接种环等。
【方法】
（一）细菌涂片的制作
1. 涂片：取清洁无油污载物玻片一张，接种环沾取生理盐水1~2环置于玻片中央，再将接种环火焰灭菌待冷后，沾取葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水中，轻轻涂成均匀薄膜。
2. 干燥：室温自然干燥，也可将涂面向上，远离火焰上方微加温干燥（切勿加热过度，以防将标本烧枯）。
3. 固定：标本干燥后，通过酒精灯火焰三次（约2~3秒钟），以杀死细菌并使之固定于玻片上。
4. 染色：可根据不同的染色要求，用相应染色液进行染色。
（二）革兰染色法：涂片的制备方法同前，革兰染色方法可分为四步。
1. 初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液数滴，覆盖整个涂面，室温作用一分钟。用自来水轻轻冲洗，甩干水分。
2. 媒染：滴加鲁戈碘液，室温作用一分钟，自来水冲洗，甩干水分。
3. 脱色：将载物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，边提边看，见涂面无色素下流为止（约30秒钟）。自来水冲洗，甩干水分。
4. 复染：加稀释复红染液染30秒钟，自来水冲洗，吸水纸吸干玻片水分。
5. 加油镜检：染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。
（三）美兰染色法
【方法】
将涂片固定滴加美兰染液于玻片上，染1~2分钟，水洗、待干、镜检。
【结果】
此法为单染色法，菌体和细胞均染成蓝色。常用于脑膜炎球菌及白喉杆菌等细菌染色。
四、细菌基本形态和特殊结构观察
（一）基本形态（示教）
1. 球形：葡萄球菌革兰染色标本片——菌体正园形，染成兰紫色，呈现葡萄串状排列。G 球菌。
2. 杆形：大肠杆菌革兰染色标本片——菌体短杆状，染成红色，呈分散排列。G-杆菌。
3. 螺形：霍乱弧菌革兰染色标本片——菌体弧形，染成红色，呈分散排列。G-弧菌。
（二）特殊结构示教
1. 鞭毛：伤寒杆菌鞭毛染色片——菌体较粗大杆状，染成兰灰色，单个或成堆存在，周围可见到波浪状弯曲、较长、呈兰灰色的鞭毛。
2．荚膜：肺炎双球菌荚膜染色片——视野背景为红色，其中可见到染色呈深红色，矛头状菌体，纵向成双排列，菌体周围有未染上颜色的空白区，即荚膜。
3. 芽胞：破伤风梭菌芽胞染色片——菌体为细长杆状，顶端有染成红色、并大于菌体的球状物即芽胞，呈“鼓槌状”，其他散乱分布的红色球体，为菌体脱落的成熟芽胞。
《附录》
革兰（Gram）染液的配制
1. 结晶紫染液
将1份结晶紫酒精饱和液与4份1%草酸铵水溶液混合即成（14克结晶紫加95%酒精100毫升即为酒精饱和溶液）。
2. 鲁戈（Lugol）碘液
碘1克 碘化钾2克 蒸馏水300毫升
3. 稀释复红液
1份硷性复红饱和液（硷性复红3.2克溶于95%酒精100毫升中。即为硷性复红饱和溶液）加9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液（抗酸染色用），取1份石炭酸复红染液加9份蒸馏水即为稀释复红染液。
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