目的要求：
了解病毒形态检查、分离培养常用的方法；熟悉病毒血清学诊断技术的原理和常用方法；了解分子生物学诊断技术——PCR法的原理、操作及应用。
实验性质：演示
实验内容：
一、电子显微镜下病毒形态观察
含有高浓度病毒颗粒的样品，可直接应用电镜技术（electromicroscopy, EM）观察。对那些不能进行组织培养或培养有困难的病毒，可用免疫电镜技术（immunoelectromicroscopy, IEM）检查，即先将标本与特异性抗血清混合，使病毒颗粒凝聚，这样更便于在电镜下观察，可提高病毒的检出率。用此法从轮状病毒感染者的粪便标本、HBV或HIV感染者的血清标本及疱疹病毒感染者的疱疹液中，均可快速检出典型的病毒颗粒，故可帮助早期诊断。
（一）负染技术 负染技术是用重金属染液里的金属原子作为电子"染料"，把密度较低的生物标本（病毒）包饶而形成明显反差的方法。细胞或组织标本制成超薄切片后可以进行负染。
材 料
①待检病毒悬液
②2%磷钨酸染液
③带膜的载网
方 法
1．等量的病毒悬液和2%磷钨酸染液混合
2．用毛细管滴到有膜的载网上
3．吸去过多的病毒染液混合物
4．电镜观察
注意事项
负染技术应用于临床标本时，往往遇到病毒量不足的问题，可用以下两种方法加以改善。
①用0.1%牛血清白蛋白水溶液处理（洗）载网。
②将载网置真空喷镀仪中进行辉光放电（glow discharge）。
（二）免疫电镜技术 病毒颗粒经过特异性抗体结合并凝聚成团之后，在负染下显示出病毒结构或包被病毒颗粒的抗体，这种电镜技术称做免疫电镜技术。
材 料
①待检病毒悬液
②已知抗体（恢复期病人血清或动物免疫血清）
③其他同负染法
方
法
1．0.9ml 的病毒悬液，加0.1ml 1:10稀释的恢复期病人血清（或用已知病毒免疫血清）充分混合。设阳性对照。
2．混匀后，37℃，孵育1h。
3．制作电镜标本。
4．负染后电镜观察
二、动物接种
动物接种是分离病毒较早应用的方法。本法在分离病毒方面，现多已被组织培养法所取代，但因某些病毒对其敏感性强(如Coxsackie A病毒)或因根据科学研究制作"动物模型"的需要，至今仍有其重要性。此法有两个缺点：① 动物本身可能带有病毒；② 许多病毒受种属特异性限制。分离病毒常用的动物有小白鼠、豚鼠、家兔及猴子等。接种途径有颅内、鼻腔及腹腔接种等。
(一)小白鼠脑内接种法
材
料 脑炎病毒悬液、小白鼠(3w龄)、1ml的注射器、针头、碘酒、酒精消毒棉球等。
方
法
1．以左手将小白鼠头部和体部固定于台面。
2．碘酒、酒精消毒头部右侧跟、耳间部位。
3．以1ml注射器抽取病毒悬液，以右手持注射器，将针头向眼外与耳根边线略偏耳的方向刺入颅腔，约进针2~3mm，注入量为0.02~0.03ml。
4．注射完毕，将用过之物煮沸消毒。
结
果 接种后每日观察动物两次。动物一般在接种后3~4d后开始发病，食欲减退，活动迟钝，耸毛、震额、卷曲，尾强直，逐渐导致麻痹、瘫痪及死亡。
(二)小白鼠滴鼻感染法 材
料 小白鼠、鼠肺适应株流感病毒悬液、无菌毛细滴管及灭菌小试管、麻醉乙醚、棉球等。
方
法 1．将小白鼠放入带盖小容器内，容器内放置蘸有乙醚的棉球，将小白鼠进行全身麻醉，注意麻醉深度，不能太深或太浅。
2．用无菌毛细滴管吸取病毒悬液少许，连同毛细滴管插入无菌小试管内备用。
3．用左手将小鼠握在掌中，拇指及食指抓住小鼠耳部使其头部朝前并呈仰卧位，另一手将事先吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴出一点于滴管口而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴靠近动物鼻尖，使其液滴随动物呼吸时带入，一般滴入0.03-0.05ml，不宜过多。
结
果 动物慢慢苏醒，放鼠笼中逐日观察。通常在数日开始发病，其症状常为耸毛，咳嗽，不食甚至死亡。解剖可观察到肺脏有肺炎或出血性病状。若病毒悬液被吸入肺内，可引起肺水肿，常于接种后1d内死亡。
三、鸡胚培养法 鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，操作简便，管理容易，本身带病毒的情况少见。对某些呼吸道病毒如正粘病毒、副粘病毒、痘类病毒、疱疹病毒和某些脑炎病毒很敏感，可用来从病人材料中分离上述病毒。 实验室常用的鸡胚接种法有尿囊接种、绒毛尿囊膜接种、卵黄囊接种及羊膜腔接种。按各类病毒在鸡胚中的适宜生长部位选用适当方法接种。
材
料 1．来享鸡受精卵、卵架、检卵灯
2．碘酒、酒精消毒棉球
3．灭菌的手术刀、镊子、剪刀
4．1ml注射器及针头
5．病毒液：流感病毒、乙型脑炎病毒、单纯疱疹病毒
6．石蜡、透明胶纸
方法及结果观察 （一）尿囊腔接种法： 1．取孵育10~12d鸡胚，在检卵灯下画出气室界线，于胚胎附近无大血管处画出标记作为注射入口。
2．将卵置卵架上，消毒标记处，用无菌剪刀尖在标记处打一小孔。
3．用灭菌注射器吸取流感病毒液0.2ml，由小孔刺人0.5cm后，进行注射。
4．注射后，用加热熔化的石蜡封孔，置35℃温箱孵育。
5．每日在灯下检视鸡胚情况(若鸡胚在接种后24h内死亡为非特异性死亡，应弃之)。孵育3d后取出，放4℃冰箱过夜，次日取出鸡胚，消毒气室端卵壳，用无菌剪刀击破气室端卵壳，用小镊子在无大血管处撕破卵膜，以无菌毛细管吸取尿囊液，放入无菌试管中待作血球凝集试验,作病毒鉴定及进行传代培养。
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