病毒试验技术
- 点击： 作者：51protocol 来源：51protocol 日期：2007-05-09 本站论坛
（二）绒毛尿囊膜接种法：
1．取10~12d龄鸡胚，于检卵灯下标记胎位，在附近无大血管处及气室端碘酒酒精消毒。
2．用小锯片在标记处卵壳上锯一三角形，同时于气室端用刀尖锥一小孔。
3．用针头挑去三角形之卵壳，勿伤及卵壳膜，滴加灭菌生理盐水一滴于壳膜上。
4．用橡皮乳头从气室小孔吸气，可见盐水被吸下，绒毛膜下沉，去壳膜后可见人工气室已形成。
5．以注射器吸取0.2～0.5ml单纯疱疹病毒液滴于绒毛尿囊膜上，无菌透明胶纸封口，37℃孵育。
6．孵育2d后，一旦发现鸡胚活动减弱，血管昏暗模糊处于濒死状态者，即取出放4℃冰箱，如不死亡，经4~5d再放人冰箱过夜后取出。消毒卵壳，除去透明胶纸，扩大气窗。观察绒毛尿囊膜上出现白色斑点，为病毒在绒毛尿囊膜细胞中生长所形成的病变。剪下有病变的绒毛尿囊膜，经固定后，可长期保存。
（三）卵黄囊接种法： 1．取6~8d鸡胚，检卵灯下画出胎位和气室，垂直放于卵架上，气室端向上。
2．碘酒酒精消毒气室中央，以无菌剪刀尖锥一小孔。
3．以1ml注射器及12号针头吸取乙型脑炎病毒液0.5ml，自小孔穿入垂直接种于卵黄囊内，深度为3cm左右。注入标本0.2~0.5ml，退出注射器。以胶纸封口，37℃孵育，每天检卵并翻动2次。
4．取孵育24h以上濒死的鸡胚，于无菌气室端开窗，用镊子提起卵黄蒂，挤去卵黄液，用无菌生理盐水洗去卵黄囊上的卵黄液后将卵黄囊置于无菌平皿内，低温保存、备用。
（四）羊水囊接种法： 1．取12d鸡胚，检卵灯划出气室及胚胎位置。
2．在气室端开方形天窗，紧捏无菌镊子，选无大血管处，快速穿刺绒毛囊尿囊膜，镊子头进入尿囊后，再夹起羊膜，轻轻将其自绒毛尿囊膜破裂处拉出，以1ml注射器穿破羊膜，注入病毒液0.1~0.2ml，用镊子将羊膜轻轻送回原位，用无菌透明胶纸封闭气室端天窗，37℃孵育。
3．培养3~5d后，消毒人工气室，剪去壳膜及绒毛尿囊膜，吸弃尿囊液,夹起羊膜，用细头毛细吸管穿入羊膜吸取羊水于小瓶中冷藏。
四、组织培养法
组织培养法是目前培养病毒应用最广的方法，经济适用，结果正确敏感，较实验动物易控制和管理。组织培养法是用离体的活组织或细胞来培养病毒，组织来源多种多样，如各种动物组织、鸡胚组织、人胚羊膜组织或人胚组织等。实验室常用的细胞有原代细胞如鸡胚单层细胞、人胚肾及猴肾细胞；传代细胞如HeIa细胞及二倍体细胞等。现以原代细胞培养为例简述如下：
材 料 1．健康小兔（15-20d龄）
2．试剂及培养液： Hank's
胰蛋白酶（0.5%）
生长液
维持液
5%NaHCO3
抗生素（青霉素及链霉素）等
3．玻璃器材：平皿、三角烧杯、培养瓶、吸管等（均须经洗涤液浸泡洗涤，蒸馏水冲洗、高压灭菌后使用）。
方法 1．制备肾组织块
①猛击头部或用无菌注射器经耳静脉注入气体处死小兔，无菌取出肾脏放灭菌平皿中。
②用加有抗生素的Hank's液洗涤后，用眼科镊子剥去肾包膜，用剪刀取肾脏表面皮质部分，并将其剪成1~1.5mm3的小块。
③再用Hank's液洗涤数次至溶液透明为止，将组织块移入三角烧瓶中。
2．消化：有冷消化和温消化(37℃)两种方法，本实验应用冷消化法。
①将0.5％胰蛋白酶与等量的Hank's溶液混合，使胰蛋白酶浓度为0.25％。
② 向装组织块的三角烧瓶中加入0.25％胰蛋白酶25~30m1(根据组织块多少可适当调整胰蛋白酶浓度及用量)。
③ 放4℃冰箱消化过夜。
④ 弃去0.25％胰蛋白酶。
3．分散细跑
①取适量生长液(20-30m1)加入已消化的组织块的瓶内。
②用10m1吸管反复吹打组织块，使细胞分散。
③吹打后，待余下的大组织块自然沉淀后(或用双层纱布过滤)，吸出上层细胞，悬液放于另一瓶中。
4．计数细胞
①吸出0.5ml细胞悬液，加入0.1％结晶紫枸橼酸溶液1ml，置室温3~5min。
②用吸管取上述悬液，滴入血球计数盘内，按白细胞计数法计数四角四大格内细胞总数(仅计算有胞浆和胞核完整的细胞)，按以下公式算出每毫升（ml）的细胞数。
五、流感病毒的血凝与血凝抑制试验
（一）血凝实验 根据各种病毒的性质不同及接种于鸡胚的部位不同，应采用不同的观察指标检测病毒的增殖情况。流感病毒颗粒表面有血凝素，具有使鸡、豚鼠血红细胞凝聚的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待检的鸡胚尿液或羊水中，如出现血细胞凝聚现象，即表示有病毒存在，这种试验称血红细胞凝集试验，简称为血凝试验。具体方法如下：
材
料 1．已接种流感病毒的鸡胚
2．鸡红细胞悬液（0.5%）
3．生理盐水
4．吸管、小试管等。
方
法
1．用镊子击破感染的鸡胚气室端卵壳，撕去壳膜，在无大血管处穿破绒毛尿囊膜以无菌乳头吸管吸取尿液；如以羊水囊接种法分离病毒时，则小心刺破羊水囊，用吸管取羊水，放入无菌试管内，待检测。
2．取10支小试管在试管架上排成一行。
3．按表9－2加入各材料（均以ml数）
4．摇匀，置室温30-60min（注意不要摇动试管）。
结果观察 1．首先观察对照管，红细胞应无凝集。
2．观察实验管，各管出现的红细胞凝集程度以++++、+++、++、+、-表示，判定标准如下：++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐。
+++ 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。 ++ 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。 +只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。
-不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。
凝集效价：能使红细胞呈++凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。如上述第5管为++，则该病毒悬液效价为1：160，即病毒稀释到1：160时，每0.25ml中含一个血凝单位。
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