• 病毒试验技术

• 点击：    作者：51protocol   来源：51protocol 日期：2007-05-09    本站论坛

（二）血凝抑制试验 　　流感病毒的血凝性，可被免疫血清中的特异性抗体所抑制，此试验称血凝抑制试验，常用于流感病毒等粘病毒或副粘病毒的鉴定。具体方法如下：
　　材  料 　　1．流感病毒感染的鸡胚尿液（4u/0.25ml）
　　2．病人血清
　　3．0.5%鸡红细胞悬液
　　4．生理盐水
　　5．吸管、小试管等。
　　方  法 　　1．排列小试管10支于试管架上。
　　2．按表9-3顺序等倍稀释诊断血清，将第1管的10倍稀释血清0.25ml移至第10管作为血清对照，同时再从第1管弃掉0.25ml，使管内血清量与其他管一致。
　　3．向各管加入流感病毒0.25ml。
　　4．向各管加入0.5%鸡红细胞悬液各0.25ml。
　　5．摇匀后置室温30-60分钟后观察结果。
　　　　
结果观察
　　判定各管血细胞凝集的情况，方法与流感病毒血凝试验相同。
　　血凝抑制效价：完全抑制血细胞凝集的血清最高稀释度即为该血清的血凝抑制效价。如完全抑制到第5管，则效价为1：160。
　　鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似。血凝抑制试验亦可用已知病毒抗原，测定病人血清抗体以进行血清学诊断，恢复期比初期抗体效价增高4倍以上才有诊断意义。

六、乙型肝炎病毒的血清学检测法　　乙型肝炎病毒目前培养困难，临床主要测定乙型肝炎病毒的各种抗原和抗体做辅助诊断。实验室常用对流免疫电泳法及反向间接血凝法。目前临床上多用固相酶联免疫吸附试验(ELISA)。

原  理　　采用双抗体夹心法，将特异性抗-HBs吸附于固相载体表面，当加入待检血清中相应的HBsAg时，结合形成Ag-Ab复合物，加入过氧化物酶标记的抗-HBs酶结合物，有酶相应底物存在情况下，产生颜色变化，用肉眼判读或酶标仪测定结果。
　　材  料
　　1．包被液：0.2M pH9.6的碳酸盐缓冲液
　　2．洗涤液：0.02M pH7.4的PBS-Tween20(0.05％)液.
　　3．酶结合物：用辣根过氧化物酶标记的抗－HBs
　　4．酶抗体稀释液：0.01M pH7.4的PBS-Tween20(0.05％)液
　　5．酶底物液：邻苯二胺(OPD)10mg溶于pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液25m1中，临用前加入30％H2O212ml。新鲜配制，避光
　　6．中止液：2M H2SO4
　　7．待检血清、阳性血清、阴性血清
　　8．聚苯乙烯微量板，微量移液器，吸头等
　　方  法 　　1．包被：用包被液稀释抗-HBs为50ug／ml，加入微量板100ul/孔，置40℃过液后，用洗涤液洗3次每次3~5min。
　　2．加样：加入稀释为1／50的待检血清100ml／孔每个标本作2孔，同时作阳性、阴性和空白对照，置37℃ 2h后洗涤3次。
　　3．加酶结合物:加入经适当稀释的酶结合物100ul／孔，置37℃ 2h后洗涤3次。
　　4．加底物液100ul/孔，避光置于37℃ 20~30min。
　　5．中止反应：加1滴／孔中止液。
　　结  果 　　肉眼判读时，待测孔颜色与阴性对照一样或更浅，判为阴性。若明显加深，呈黄棕色，判为阳性。用酶标仪检测时，P／N值＞2．1为阳性，＜2．1为阴性。P为被检标本OD值，N为阴性对照OD值。
　　诊断结果：
　　1．称大三阳，为慢性肝炎，处于活动期。有较强的传染性。
　　2．称小三阳，为慢性携带者，乙肝已趋向恢复，传染性弱，如持续时间过久，可转化为肝癌。 　　3．感染阶段或慢性乙肝表面抗原携带者，传染性弱。
　　4．感染过乙肝病毒，具有一定的免疫力，为不典型的恢复期或为急性乙肝感染期。
　　5．乙肝感染，为肝炎恢复期，少数人仍有传染性。
　　6．去有乙肝感染或现在正处于急性感染。
　　7．前打过乙肝疫苗或以前感染过乙肝。
　　8．性乙肝恢复期，以前感染过乙肝。
　　9．急性感染早期或者慢性乙肝表面抗原携带者，传染性弱。
　　10．慢性乙肝表面抗原携带者，较易转阴，或者是急性感染，趋向恢复。
　　11．早期乙肝感染，或慢性携带者，传染性强。
　　12．急性乙肝感染趋向恢复，或者为慢性携带者。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
七、PCR方法检测病原微生物
　　多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。经过20-30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。
　　PCR方法操作简便，灵敏度高，可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。
　材  料　　1．无菌双蒸水、石蜡油、溴化乙锭
　　2．10×PCR反应缓冲液
　　3．25mmol dNTP混合液
　　4．引物1，引物2各50pmol／u1
　　5．模板DNA
　　6．5U／ul Taq DNA聚合酶
　仪  器　　1．PCR扩增仪
　　2．电泳仪
　　3．紫外线分析仪
　方  法　　1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：
　　10×PCR反应缓冲液 5u1
　　引物1 2ul
　　引物1 2ul
　　模板DNA 10u1
　　dNTP混合液 4ul
　　Taq DNA聚合酶 1ul
　　无菌双蒸水 加至 50ul
　　混匀, 加50 ul石蜡油，防止样品水分蒸发。
　　2．将反应管置于PCR仪中，94℃变性4min。然后按94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循环35次后，72℃延伸10 min。
　　3．反应完成后，取l0ul PCR扩增液，加至2％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压100V，电泳30~60min后，置紫外线分析仪下观查扩增结果。