| 糖化曲的制备及其酶活力的测定 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-09-21 本站论坛 |
|  | 糖化曲的制备及其酶活力的测定（侯红萍）
1 目的
1.1 学习制作糖化曲的方法。
1.2 掌握糖化酶活力的测定的原理和方法
2 原理
2.1 淀粉糖化为可发酵性糖
糖化曲是发酵工业中普遍使用的淀粉糖化剂。种类很多，如大曲、小曲、麦曲和麸曲等。曲中菌类复杂，曲霉菌是酒精和白酒生产中常用的糖化菌，含有许多活性强的糖化酶，能把原料中的淀粉转变成可发酵性糖。在酒精和白酒生产中应用最广的是黑曲霉。黑曲霉是好气性菌，生长时需要有足够的空气。因此，在制备固体曲时，除供给其生长繁殖必需的营养、温度和湿度外，还必须进行适当的通风，以供给曲霉呼吸用氧。
2.2 糖化酶活力的测定
固体曲糖化酶活力的测定，采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度条件下，使之水解为葡萄糖，以斐林试剂快速法测定。斐林试剂由甲、乙液组成，甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时，二者等体积混合。混合时硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀, 沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解。
酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中的羰基氧化，而二价铜被还原成一价的氧化亚铜沉淀。
反应终点用次甲基蓝指示剂显示。由于次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量一滴还原糖被次甲基蓝氧化，次甲基蓝本身被还原，溶液蓝色消失以示终点。
温度对糖化酶活力影响甚大，糖化温度一定要严格控制。反应是在强碱性溶液中，沸腾情况下进行，产物极为复杂，为得到正确的结果，必须严格按操作规程进行。斐林试剂甲、乙液平时应分别贮存，用时混合。反应液的酸碱度要一致，要严格控制反应液的体积。反应时温度需一致，温度恒定后才加热，并控制在2min内沸腾。.5滴定速度需一致（按1滴/4~5s的速度进行）。反应产物中氧化亚铜极不稳定，易被空气所氧化而增加耗糖量。故滴定时不能随意摇动三角瓶，更不能从电炉上取下后再行滴定。
3 材料
3.1 菌种
AS3.4309黑曲霉斜面试管菌。
3.2 培养料
麸皮，稻皮。
3.3 试剂
斐林试剂，0.1%标准葡萄糖溶液，pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，可溶性淀粉溶液，0.1mol/L NaOH溶液，
3.4仪器和器具
恒温水浴箱、恒温培养箱、高压锅、瓷盘、试管、三角瓶、50ml比色管或容量瓶、酸式滴定管。
4 流程
4.1 麸曲制备
斜面试管菌→活化
↓
麸皮+水→拌料→蒸料→装瓶→灭菌→冷却→接种→培养→三角瓶种曲
↓
麸皮+水→拌料→蒸料→冷却→接种→装盘→培养→晾干→麸曲
4.2 糖化酶活力测定
麸曲浸出液→固体糖化液→定糖→糖化液测定→计算结果→记录
5 方法
5.1糖化曲制备（以浅盘麸曲为例）
5.1.1 菌种的活化
无菌操作取原试管菌一环接入察氏培养基斜面，或用无菌水稀释法接种，31℃保温培养4~7天，取出，备用。
5.1.2 三角瓶种曲培养
称取一定量的麸皮，加入70%~80%水，搅拌均匀，润料1h，装瓶，料厚约1.0~1.5cm，包扎，在9.8%26#215;104Pa压力下灭菌40min。冷却后接种，31~32℃培养，待瓶内麸皮已结成饼时，进行扣瓶，继续培养3~4天即成熟。要求成熟种曲孢子稠密、整齐。
5.1.3 糖化曲制备
5.1.3.1配料
称取一定量的麸皮，加入5%稻皮，加入原料量70%水，搅拌均匀。
5.1.3.2蒸料
园气后蒸煮40~60min。时间过短，料蒸不透对曲质量有影响；过长，麸皮易发粘。
5.1.3.3接种
将蒸料冷却，打散结块，当料冷至40℃时，接入0.25~0.35%（按干料计）三角瓶种曲，搅拌均匀，将其平摊在灭过菌的瓷盘中，料厚约1~2cm。
5.1.3.4前期管理
将接种好的料放入培养箱中培养，为防止水分蒸发过快，可在料面上覆盖灭菌纱布。这段时间为孢子膨胀发芽期，料醅不发热，控制温度30℃左右。约8~10h，孢子已发芽，开始蔓延菌丝，控制品温32~35℃。若温度过高，则水分蒸发过快，影响菌丝生长。
5.1.3.5中期管理
这时菌丝生长旺盛，呼吸作用较强，放热量大，品温迅速上升。应控制品温不超过35~37℃。
5.1.3.6后期管理
这阶段菌丝生长缓慢，故放出热量少，品温开始下降，应降低湿度，提高培养温度，将品温提高到37~38℃，以利于水分排除。这是制曲很重要的排潮阶段，对酶的形成和成品曲的保存都很重要。出曲水分应控制在25%以下。总培养时间约24h左右。
5.1.3.7 糖化曲感官鉴定
要求菌丝粗壮浓密，无干皮或“夹心”，没有怪味或酸味，曲呈米黄色，孢子尚未形成，有曲清香味，曲块结实。
5.2 糖化酶活力测定
5.2.1 浸出液的制备
称取5.0g固体曲（干重），置入250ml烧杯中，加90ml水和10ml pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液，摇匀，于40℃水浴中保温1h，每隔15min搅拌一次。用脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲浸出液。
5.2.2 糖化液的制备
吸取2%可溶性淀粉溶液25ml，置入50ml比色管中，于40℃水浴预热5min。准确加入5ml固体曲浸出液，摇匀，立即计下时间。于40℃水浴准确保温糖化1h。而后迅速加入0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度。
同时作一空白液：吸取2%可溶性淀粉25ml，置入50ml比色管中，先加入0.1mol/L氢氧化钠溶液15ml，然后准确加入5%固体曲浸出液5ml，40℃水浴中准确保温1h后用水定容至刻度。
5.2.3 葡萄糖测定
空白液测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入150ml三角瓶中，加空白液5ml，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液在1ml以内，加热至沸，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min内完成。
糖化液测定：准确吸取5ml糖化液代替5ml空白液，其余操作同上。
5.2.4 计算
固体曲糖化酶活力定义：1g 干重固体曲，40℃、pH4.6、1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。
50 100 1
糖化酶活力 =（V0—V）%26#215;C%26#215;——%26#215;——%26#215;——%26#215;1000
5 5 W
式中 V0——5ml空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（ml）
V ——5ml糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（ml）
C —— 标准葡萄糖溶液的浓度（g/ml）
50
— ———5ml糖化液换算成50ml糖化液中的糖量（g）
5
100
—— ——5ml浸出液换算成100ml浸出液中的糖量（g）
5
W—— 干曲称取量（g）
1000 ——g 换算成mg
6 结果
6.1 记录制曲过程中观察到的现象。
6.2 酶活力测定结果列表记录。
7 思考
1 固体曲和液体曲相比，各有何优缺点？
2 糖化酶活力测定中应注意哪些因素？
上一篇： 培养基的配制与灭菌 下一篇：酸乳中乳酸菌的测定
| | |
|
|
|
