酱油种曲孢子数及发芽率的测定
一 酱油种曲孢子数 1 目的 掌握应用血球计数板测定孢子数方法。 2 原理 种曲是成曲的曲种，是保证成曲的关键，是酿制优质酱油的基础。种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，必须达到6%26#215;109个/g（干基计）以上，孢子旺盛、活力强、发芽率达85%以上，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。测定孢子数方法有多种，本 材料 3.1 样品 酱油种曲 3.2仪器和器具 盖玻片，旋涡均匀器，血球计数板，电子天平，显微镜。 3.3 试剂 95%酒精，稀硫酸（1∶10）。 4 流程 曲种→称量→稀释→过滤→定容----制记数板----计算？？？？ 5 方法 5.1样品稀释 精确称取种曲1g（称准至0.002g），倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶内，加入95%酒精5ml、无菌水20ml、稀硫酸（1:10）10ml，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不含孢子，最后稀释至500ml。 5.2制计数板 取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。 5.3观察计数 5.3.1 观察 用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。 5.3.2 计数 使用16%26#215;25规格的计数板时，只计板上四个角上的4个中格（即100个小格），如果使用25%26#215;16规格的计数板时，除计四个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即80个小格）。每个样品重复观察计数不少于2次，然后取其平均值。 5.4计算 （1）16%26#215;25的计数板 孢子数（个/g）=(N/100) %26#215;400%26#215;10000%26#215;(V/G)=4%26#215;104%26#215;(NV/G)…………（1） 式中 N——100小格内孢子总数 （个） V——孢子稀释液体积 （ml） G——样品重量 （g） （2） 25%26#215;16的计数板 孢子数（个/g）=(N/80) %26#215;400%26#215;10000%26#215;(V/G)=5%26#215;104%26#215;(NV/G) …………………………（2） 式中 N——80小格内孢子总数 （个） V——孢子稀释液体积 （ml） G——样品重量 （g） 5 流程 曲种→称量→稀释→过滤→定容→制计数板→观察计数→计算 6 结果 样品稀释至每个小格所含孢子数在10个以内较适宜，过多不易计数，应进行稀释调整。结果记入下表。 计算次数 各中格孢子数 小格平均孢子数 稀释倍数 孢子数 （个/g） 平均值 第一次 第二次 7 思考 用血球计数板孢子计数有什么优缺点？ 二 孢子发芽率测定法 1 目的 学习孢子发芽率的测定方法 2 原理 测定孢子发芽率的方法常有液体培养法和玻片培养法，部颁标准采用玻片培养法。本材料 3.1 样品 种曲孢子粉 3.2 培养基 察氏液体培养基 3.3 仪器和器具 载玻片、盖玻片、显微镜，接种环，酒精灯，恒温摇床 4 流程 种曲孢子粉→接种→恒温培养→制标本片→镜检→计数 5 方法 5.1 接种 用接种环挑取种曲少许接入含察氏液体培养基的三角瓶中，置于30℃下摇床振荡恒温培养3—5 h。 5.2 制片 用无菌滴管取上述培养液于载玻片上滴一滴，盖上盖玻片，注意不可产生气泡。 5.3 镜检 将标本片直接放在高倍镜下观察发芽情况，标本片至少同时做二个，连续观察两次以上，取平均值，每次观察不少于100个孢子发芽情况。 54 计算 发芽率（%）=A/（A+B）%26#215;100 式中 A——发芽孢子数 （个） B——未发芽孢子数 （个） 6 结果 6.1正确区分孢子的发芽和不发芽状态。 6.2培养前要检查调整孢子接入量，以每个视野含孢子数10—20个为宜。 6.3 发芽和未发芽孢子数（A+B） 发芽率（%） 平均值 7 思考 影响孢子发芽率的因素有哪些？哪些实验步骤容易造成结果误差？
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