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通过 DNA 提取和 PCR 扩增反应对食品中转基因成分进行检测
Laurent Thion, Christine Vossen, Bettina Couderc, Monique Erard, and Blandine Clemenc
摘要
本文介绍的是一个通过 DNA 提取、纯化以及 PCR 扩增来对大豆中外源性 DNA 序列进行检测的方法。从少量的大豆粉中提取并纯化 DNA ，利用不同的特异性引物进行 PCR 反应，再通过电泳结果来决定样品中是否有转基因成分。实验的主要目的是熟悉一些常规技术，如 DNA 提取与纯化，以及 PCR 技术的理论和应用。
转基因生物（ GMO ）的检测在农业与食品工业中的用途十分广泛 [1-4] 。学术界对转基因生物的观点各不相同，一方面可以利用转基因技术来产生抗病、抗虫害型作物来增加农业产量，而另一方面，转基因生物与野生群落的共同分布可能会威胁到物种的多样性。从长远看来，转基因生物对整个环境和人类的影响还是未知的。这也就是一些国家的议员们始终对转基因作物实行严格地控制，并使其不能普及的原因。在欧洲，必须明确标示食物中的转基因成分。而对于那些标有不含转基因成分的食物来说，生产商必须确定其所用的原材料一定是不含转基因成分的，为此政府已建立了检测食品中转基因成分的体制。其中，最重要的是转基因检测方法的可靠性和有效性，所以我们利用分子生物学技术建立起一套基于 PCR 反应的实验方案，用于食品质控实验室的工作。最要害的是第一步： DNA 提取，我们做了很严格的监控 [5] 。
要害词
我们依据植物基因组和质粒 DNA 的提取效率来选择 DNA 提取试剂盒。整个提取过程包括破坏细胞壁、去除 RNA 和利用沉淀去除蛋白质，然后将 DNA 吸附在层析柱上，经过洗涤后再洗脱下来。类似的方法已经用于从其他一些植物 [6] 和病毒 [7] 中提取 DNA 。
在本实验中，我们用 PCR 来确定大豆粉中是否含有转基因成分。这种技术也可用于各种相关研究，如古生物学和法医学 [8 –12] 。 PCR 反应的过程分为三个阶段：1) 通过加热使双链 DNA 变性。 2) 降低温度使得引物与模板序列结合。3) DNA 链沿着引物方向延伸。这三个步骤称为一个循环， PCR 是由若干个重复循环组成的。 DNA 的数量呈指数扩增，表示为 2 n ，其中 n 代表循环数。这就意味着每经历一个循环， DNA 量增长一倍。理论上， 30个循环后 DNA 被扩增了 10 9 倍，从而可以清楚地在电泳凝胶上显示出来。
实验中的 PCR 引物是针对两种类型的基因设计的，第一对引物是用来扩增内源性植物基因，如叶绿体基因和特异性的大豆 lectin 基因，以证实植物 DNA 尤其是大豆 DNA 的存在。第二对引物是扩增通过基因转化而引入的外源序列，这些序列通常不存在于野生型植物中。其中，这两个外源的 DNA 序列与花椰菜花叶病毒的 35 S 启动子和 根癌农杆菌 的 NOS 终止子整合在一起。假如这两个序列的任一个被扩增出来，则表明外源基因已经转化入植物基因组中。原则上所有已批准的转基因农作物都是用含有这两个元件或其中任一个的构建载体转化的。对于一些在转基因构建载体中新使用的启动子和终止子序列的检测，逐渐成为科学家们关注的焦点。目前，已经设计了一些针对不同大小产物的引物对。表 1为合成的引物序列，选择退火位点生成单一 DNA 片段，以便于结果的分析。 PCR 反应后，这些片段可以在琼脂糖凝胶电泳上以条带的形式显现出来。
实验过程
材料：
大豆粉 (转基因的和非转基因的) 分别购于 Soy Bean Powder SB-Set 和 Fluka
植物 DNA 提取试剂盒 ( DNeasy? plant kit )
Taq PCR core kit （ Qiagen ）
琼脂糖凝胶电泳系统 ( Amersham Biosciences, Inc. )
方法：
植物 DNA 的提取与纯化
利用 DNeasy?plant kit ，依照下列步骤进行 DNA的提取与纯化：
• 预热 AE buffer 到 65℃ ；
• 称取大豆粉 0.1 g ，放入 2 ml Eppendorf 管；
• 加入 400 μl AP 1 buffer 和4 μl RNase （ 100 mg/ml ），混匀，注重避免皮肤接触 AP 1 buffer ；
• 65℃孵育10-15 min ；
• 加入 130 μl AP 2 buffer ，混匀，置于冰上 5 min ，（在酸性溶液中蛋白质和多聚糖可发生沉淀），冰浴，沉淀未折叠的蛋白质，或使其他蛋白质发生错误折叠，并灭活 DNA 酶。溶液 AP 2含乙酸，应避免皮肤接触；
• 12000× g 将混合液在 QIA shredder 离心柱上离心2 min （以除去细胞壁和沉淀）；
• 将溶液转移至另一干净的 2 ml Eppendorf 管中，弃去沉淀；
• 加入 0.5倍体积的 AP 3溶液，混匀。为了避免氯化物的生成，不要将 AP 3溶液与次氯酸钠混合；
• 加入 1倍体积的无水酒精，混匀；
• 将溶液放在 DNeasy minispin 柱上， 10000× g 离心 1 min （使 DNA 附着在层析柱上）。柱子的最大容积为 650 μl ，此步骤可重复若干次；
• 将柱子放置于新的 2 ml Eppendorf 管中；
• 吸取 500 μl AW buffer 放入柱子中心， 10000× g 离心 1 min （洗涤 DNA ，除去盐分）；
• 重复一次，吸取 500 μl AW buffer 放入柱子中心， 10000× g 离心 2 min （确保除去所有的缓冲液），在使用前 2 min 从温育中取出 AE buffer ；
• 将柱子放置于一新的 2 ml Eppendorf 管中；
• 吸取 100 μl AE buffer 放入柱子中心， 10000× g 离心 1 min （洗脱 DNA ）；
• 重复一次；
• 将装有 DNA 溶液的 Eppendorf 管置于冰上。
PCR 扩增反应
使用 Qiagen 的 PCR core kit ，用四种不同的引物对来扩增纯化的 DNA 。管 A 含叶绿体 DNA 特异性引物，管 B 含 LeCtin 特异性引物，管 C 含 NOS 终止子特异性引物，管 D 含 35 S 启动子特异性引物。每一管依次加入下列溶液：
33.9 μl 的 Ｍ illiQ 过滤水（总体积达 50 μl ）， 5 μl 10× PCR 缓冲液（ 100 m M Tris-HCl buffer ， pH 8；500 m M KCl ； 15 m M MgCl 2 ）， 5 μl 预先预备好的 DNA 溶液，混匀，置于冰上。每管中再加入 5 μl 的相应引物（起始浓度 0.1 μg/μl ），稍微混匀，置于冰上。然后再加入 0.6 μl 的 dNTP （起始浓度 10 m M ）和 0.5 μl （ 1 U ）的 Taq 酶（ QIAGEN Taq polymerase core kit ； Qiagen ）。稍微混匀，再置于冰上。
PCR反应条件：
第一步 : 94℃，10 min
第二步 : 94℃，1 min ； 63℃，1 min ； 72℃，1 min ； 34个循环
第三步 : 72℃，10 min
4℃保存。
凝胶电泳
在 PCR 反应进行中，用 0.5× TBE 制备 3 % w/v 的琼脂糖凝胶。 PCR 完成后，分别用四个 Eppendorf 管将 8 μl 的扩增产物与1 μl 6×加样缓冲液(含10 % 甘油的 0.3 M EDTA ， 0.25 % 溴酚蓝， 0.25 % 二甲苯胺和 0.25 % Orange G )混合。在第五个管中将3 μl 100- bp DNA ladder 和 0.5 μl 6×加样缓冲液混合。分别依次将样品加入凝胶的加样孔内，在200伏电压下进行电泳，直到 Orange G 跑到胶的最下端（大约需 30 min ）。电泳终止后，用溴化乙锭染色，在紫外灯照射下观察条带，并拍照记录（图 1）。
结果分析
图 1中的 M 列为 100- bpDNA marker ， 包含了 100-1500 bp 的片段。 1-8列为 PCR 扩增的结果。 1和7为叶绿体基因的扩增结果，2和8是 Lectin 基因的扩增结果， 3和5为 35 S 的扩增产物， 4和6为 NOS 扩增产物。
从图中可以看出两种可能的结果，前四列为非转基因大豆的 DNA 扩增结果，而后四列为转基因大豆的扩增结果。
在 1和7中，500 bp 的清楚条带代表叶绿体基因的扩增片段，这表明提取物中有植物 DNA 。 2和8中的118 bp 条带代表大豆凝集素的基因，这可以证实大豆 DNA 的存在。
在另两组中，假如我们分别在 727 bp （ NOS 扩增产物）和 199 bp （ 35 S 的扩增产物）处看到产物片段，就可确定所分析的大豆粉中含有转基因成分。同时，即使只扩增出这两个产物中的其中一个，仍可认为该样本含转基因成分。
图 2显示的实验结果，我们可以看到在转基因大豆中可扩增出所有4个序列，而非转基因大豆中只扩增出叶绿体基因和 Lectin 基因序列。
参考文献
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Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 8, No. 3, 2000, Pages 200-207
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