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动物组织或材料中盐酸克伦特罗残留的快速ELISA检测

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-08 　本站论坛

4) 直接取上清液进行检测
9.4牛奶和奶粉（稀释因子50）：
1) 取1g奶粉或1ml牛奶于50ml试管中，加3ml（牛奶加2ml）蒸馏水
2) 加100ul 5M的盐酸（调节PH至3）
3) 升温至40℃3-5分钟直至牛奶凝化，离心5分钟3500rpm
4) 加5M氢氧化钠100ul，加入46.8ml蒸馏水，用氢氧化钠或盐酸调节pH值为6.5-8之间
5) 离心15分钟3500rpm，取上清液进行检测
9.5组织样品（稀释因子50）：
1）1g粉碎的样品于50ml 试管，加50ml 0.01M HCL混合，振荡5分钟，以达到均质的目的。
2) 检查pH值是否在6.5-8之间，否则用氢氧化钠或盐酸调节
3) 离心5分钟3500rpm，转移出上清液。（如上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）
4) 直接取上清液进行检测
10.酶联免疫实验设计：
1) 将所有试剂升至室温20-25℃，一旦开始实验，一定要连续不间断。
2) 所有标准液和待测样为减少操作误差，最好同时做平行实验。
3)检测样品建议做平行实验（可以减少实验过程中因操作失误而影响实验结果）。
11.操作步骤：（孵育时间30分钟）
1) 按照所要进行测验的微孔板条，从酶标板中取出所需的微孔板条并插入框架内。
2) 吸取50ul的蒸馏水作为0标样。
3) 吸取50ul标准液和待测样品入各自的微孔内。
4) 每孔内加入50ul酶联结合物，然后再加入100ul 克伦特罗抗体溶液（该反应速度快，建议使用多道移液器）。
5) 轻轻敲击微孔板四周，室温20-25℃避光孵育30分钟。
6) 倾空微孔板，用250ul冲洗液重复洗板5次，最后，用力在吸水纸上将残余液滴拍干（洗板时，标准清洗液注满微孔，翻转微孔板倾空，尽量挤压微孔板，以防微孔板从框架上脱落）。
7) 显色：每孔加200 ul显色液，室温20-25℃避光孵育30分钟（显色液用1体积底物溶液 9体积柠檬酸缓冲液） 8) 孵育结束时，每孔加50ul反应终止液，充分混合，在450nm下读数。
12.结果计算：
1) 样品中未知的Clenbuterol通过曲线定量计算
2) 将得到的样品吸光度值减去所有空白值的平均值，计算标准液吸光值和样品吸光度值以及最大吸光度值
3) 用样品或标准液吸光度值（B）除以最大吸光度值（B0）再乘以100，最大吸光度值接近于100%的吸光度值百分率：

根据B/B₀的值做出每一个标准样品的半对数曲线，相对应每一个样品的浓度就可从曲线上读出。
13.结果分析：
由于样品在反应中经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的待测样浓度一定要再乘以其稀释因子才能得出其在样品中的正确含量。（尿液和血清的稀释因子是1，肝脏的稀释因子是3，饲料的稀释因子是10，组织的稀释因子是50，牛奶和奶粉的稀释因子是50）
14.注意事项：
1）温度低于20℃或试剂及标品没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的值偏低。
2）洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
3）标准物质和显色液对光敏感，最好避免直接暴露在光线下。
4）混合要均匀，洗板要彻底（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
5）反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
6）不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样回引起灵敏度降低。
试剂盒的储存条件是2-8℃，不要冷冻。

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