ELISA测定技术的发展和质量控制

ELISA试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。然而，影响ELISA试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。
一、ELISA试剂盒测定技术的发展
临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。
1、基因工程试剂对免疫测定技术 发展的影响
免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。
HBsAg试剂特点（检测模式：临 床抗体夹心法）：
包被抗体为山羊多抗，多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。
酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位。
可测得HBsAg变异样品。
提高检测的特异性（99.98%）
提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05nｇ/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml

2、基因工程
较早用于免疫测定的基因工程抗原是HBcAg和HBsAg,这两种基因工程抗原的出现，较好地解决了抗HBc和HBe的测定问题。因为要从病毒本身去大量获取这两种纯抗原较为困难，并且这一点对于难培养的病原微生物来说，如HIV、HCV和梅毒螺旋体等都有些共性。
2.1 HCV-ELISA试剂
HCV目前尚不能体外培养，只能用基因工程或化学合成方法获取HCV结构和非结构区的各种抗原片断，已知HCV基因组有7个功能区组成：核心、E₁、E₂/NS₁ NS₂ NS₃ NS₄ NS₅(有分为NS_5a和NS_5b)区，合成抗原的优点是易于纯化，特异性好，抗原抗体反应强。
2.1.1第一代抗HCV-ELISA试剂盒：
-由美国ortho公司克隆C₁₀₀₃抗原几个片断与人超氧化物歧化酶（SOD）结合。用酵母从病毒基因组非结合区得到表达，表达为融合蛋白，亦作为包被固相载体。
-抗原组合：NS₄ 区二个基因片断为NS _5-1-1和C₁₀₀₃
-特性：IgG抗C₁₀₀在发病后数月后，才检出，故不宜作早期诊断。
-约由20%的病人不出现抗体。IgM抗-C₁₀₀急性期检出率只有64%。
-C₁₀₀的抗原性较弱，在HCV复制中，不能充分暴露宿主的免疫系统。
-特异性和灵敏性较差。
2.1.2第二代HCV-ELISA试剂盒
-用基因重组的HCV结构蛋白与非结构蛋白抗原包被固相载体。
-抗原组合：核心区（C区）多肽C₂₂ NS区多肽C₃₃ C₁₀₀₃和NS _5-1-1
-增加C₂₂区和C₃₃区后，抗体出现早，有助早期诊断，提高阳性率。有利早期诊断。
-C₂₂是早期易出现病毒血症
2.1.3第三代HCV-ELISA试剂盒
人工合成多肽抗原，由36个氨基酸组成的Cp9(内壳蛋白)和19个氨基酸组成Cp10混合包被固相载体。
抗原组合：除有C _100-3 C₂₂ C₃₃ 外又增加了core 和NS₃ NS₄ NS₅
特点：
*core NS3 NS5由Baculovirus 重组表达，没有非特异性的 载体，试剂特异性高 ，重组的蛋白经融合形成大分子抗原，利于提高检测灵敏度。
* NS₃ 区增加了氨基酸片断（比例十分重要）。改进了反映的灵敏度。
* NS₅ 经优化，徐去了非特异性的区域（G-D-D）NS₃ NS₅是血转化最早测得的抗体，提高了诊断的准确性。
* NS₄ 为俩个片断的合成多肽，去掉了非特异性反应的区域，加强了试剂的灵敏度和特异性。
2.1.4第四代HCV—ELISA 试剂盒
-美国新近推出一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白，称为多决定基融合抗原，采用表面活性剂处理分界病毒表面复合物，释放HCV核心抗原（core）并用ELISA法，灵敏度可达500拷贝/ml，已接近核酸扩增检测水平。
-抗原组合：以Core和NS₃作为主要检测片断（比例十分重要）加合成多肽NS₄
-特点：直接测Core抗原
不易发生变异
抗IgM 和IgG检出率可达100%
特异性达99.8%灵敏度为100%