24抗原的敏感性，将血清中免疫复合物（ICD)解离后再进行测定。发展了（ICD) P24抗原测定技术。
3.1.3抗HIV-ELISA试剂
目前对HIV的检测原料有了较大改进，主要如下：
（1）可用于检测血清或血浆中HIV IgM亚特异性抗体和检测HIV-1、2和多种亚型。
（2）标记的抗原：
a.含HIV-1B亚型gp41和P24的HIV-1重组融合蛋白。
b.可特异性检测血清或血浆中HIV M群的抗体，绝大多数HIV-1.0群和HIV-2群的抗体。
c.gp36免疫调控区的HIV-2多肽可测定特异性的HIV-2抗体。
d.gp41的俩段HIV 1.0群多肽，可测特异性HIV 1.0 群的抗体 和HIV 1M群的抗体。
从以上抗原设计保证HIV的来自不同亚型/或区域的抗原亚型抗体的检测。减少了变异株的漏检。
HIV-1.0.2对759份各类临床样品包括401份HIV-1感染不同阶段病人样品，204分HIV-2感染不同阶段病人样品，和154份与HIV无关的其他疾病患者的样品的检测结果。
特异性：99.93% 灵敏度：100%
对欧洲血液中心的8842份常规鲜血者样品用HIV-1.0.2进行评价筛选，并经确认实验获得的结果。
3.1.4 HIV 确认试剂—免疫印记（WB或RIBA）试剂
判断标准
我国 HIV 抗体阳性：至少二条膜带（即gp160/gp120）或至少一条膜带和p24(核心)带同时出现
美国 HIV-1阳性（任何两个中有二条带（P24 gp41 gp120/gp160）, HIV-2无阳性
WHO : HIV -1 阳性（不管有无核心带或酶带， 但有两条膜带）
HIV-2阳性（不管有无核心带或酶带，单有两条膜带即为阳性）
4、 基因工程酶及其融合蛋白
除了基因工程抗原、抗体外，与标记免疫测定有关的另一中重要的基因工程试剂就是酶及其融合蛋白，以重组酶建立免疫测定方法较为成功的是CEDIATM均相酶免疫试验。
使用基因工程酶技术生产免疫测定标记酶，是得到符合标记要求的高纯度酶的一条新途径，但如以其他蛋白（抗原或抗体）融合的方法，不但避免了繁琐且低效率的酶与蛋白的化学交联，而且无需得到纯化的酶和抗原或抗体。随着分子生物学技术的发展，将有越来越多的酶免疫测定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基础之上。
发展趋势如下：
1）、由单一病原蛋白向多决定簇融合蛋白转变，并尽可能包括病原体基因组功能区的所有的能引起肌体免疫应答的决定簇。
2）、表达的抗原将尽可能少含有非特异性抗原 或共同抗原。
3）、为某一目的如病原体基因型确定而设计表达特定的多肽抗原片断。
总之，将围绕改善免疫测定的特异性和敏感性来制备基因工程片断。
二、 试剂盒的方法学设计
目前，ELISA的测定模式，主要有双抗体夹心法测定抗原，如HBsAg,HBeAg,AFP,HCG等；间接法测定抗体如HCV ,抗HIV 等；双抗体夹心法测抗体如HBs，竞争法测抗体，如HBe,抗HBc等；竞争法测抗原，如激素等小分子。固相捕获法测IgM抗体等，这里只简述双抗夹心法测抗原。目前有一步法和二步法之分。
1、HBsAg-ELISA法：
1.1 一步法：在加入待测物的同时加入酶结合物一起温育，一步即完成反应过程，一步法ELISA的反应曲线为钟型曲线(见图1)，也就是说测定随着待测物中抗原浓度的增加而升高至一定后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(HOOK effect)，也就是我们在免疫沉淀实验中所称的“带现象”。
一步法的反应平衡式如下：
Ab Ag Ab*→Ab·Ag·Ab* Ab·Ag Ag·Ab* Ab*·Ag·Ab*
(a) (b) (c) (d)
其中a为最后测定结果的显色源，当待测物中Ag浓度增加时，无疑会使b,c,和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*,使a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟型曲线，而且由于d复合物的形成，使得在同样的Ab*浓度下，一步显色较二步法为浅。目前一步法所出现“钩状效应”，现已有进展，即采用包被为一种抗体，酶标记用空间距离较远的决定簇的抗体，同时在操作中充分混匀反应液，并适当延长温育时间，则可使b,c和d复合物减少到最低程度，而不出现“钩状效应”
图1 一步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线
二步法：
随着待测物中抗原浓度的逐步增加，将使固相抗体与抗原的结合逐步达到饱和(见1式)，这样在一定浓度Ab*的存在下，Ab·Ag复合物的形成将直接与Ab*结合(见2式)，抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，而形成S形变化曲线(见下图2)：
Ab Ag→Ab·Ag (1)
Ab·Ag Ab*→Ab·Ag·Ab* (2)
综上所述，一步法ELISA试剂盒作为适合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大市场，其虽有潜在缺陷，易导致高浓度待测物的标本检测为假阴性，但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体的仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。
图2 二步法ELISA抗原浓度与显色变化的反映曲线
灰区概念：合并二种方法
一步法试剂其反应平衡点为图中反应曲线A点,处在抗原抗体反应的上坡图中，故受反映条件的改变而影响A值
二步法抗原抗体反应已达反应的平台期
从图见一步法A点则受反应条件的改变而影响A值。因此出现△Al(可能是假阳性)，△A2(可能是假阴性)。因此将A1—A2间的区域称为灰区。
灰区的设置有二种方法：
1、以试剂批内CV值（一般为15%左右）设定，灰区范围为CO（1 CV）
2、以试剂盒用临界值血清测定S值来设定，公式为CO 2S。
以上一般以S值确定的灰区范围比CV值确定值要大。凡灰区范围内的结果可报告可疑或重复检测。
2.HIV检测法
目前市场上也有一步法和二步法两种。，一步法存在以下三个问题：
①钩状效应（Hook Effect）：有漏检倾向
② HIV-2型抗体的检测：
P19、P20两个HIV-2型抗体强阳性标本的检测中，二步法试剂盒OD值至少比一步法试剂高出3~5倍。
（3）.本底
与一步发试剂盒相比，因二步法试剂盒标本孵育时间长。酶结合物反应充分，特异性强，不仅抗HIV-1、2型阳性标本OD值比一步法高而且本地清晰。一般二步法本地<0.02。
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