[实验目的要]
通过对乳汁中孕酮含量的测定，了解酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay，ELISA)的基本原理与检测技术。
[实验原理]
酶联免疫吸附分析法（ELISA）是通过化学的方法将酶与抗原或抗体结合，形成酶标记物（或通过免疫学方法将酶与抗酶抗体结合，形成免疫复合物）。这些酶标记（复合）物仍保持其免疫性和酶活性，再与相应的抗体或抗原发生反应，形成酶标记的免疫复合物。结合在免疫复合物上的酶，在遇到相应酶底物时，经催化水解及氧化还原等反应，形成有色产物。酶降解底物的量与呈现色泽浓度成正比。由此，可反映被测定的抗原或抗体的量。
与RIA法相似，利用被测抗原与酶标记抗原对特异性抗体进行竞争结合，测试(加入的)标记在抗原上的酶催化底物所产生的颜色反应。当特异性抗体量一定时，且小于被测和标记抗原时，未标记抗原浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中抗原含量呈负相关。
以标准抗原不同浓度为横坐标，以比色的光密度值(OD)或相应的结合率(OD/ODo%)为纵坐标，绘制标准曲线。根据被检样品的结合率在标准曲线上可查到相应的含量。
目前人们还可以使一些小分子的类固醇激素（如孕酮）与大的蛋白质分子（如牛血清蛋白）结合，成为完全抗原，并按免疫学原理获得抗体。通过检测酶标记该完全抗原的竞争性结合率，来测定该激素的含量。
[实验动物]
奶牛
[实验试剂]
发情牛鲜奶，
试剂配制：
1.孕酮抗血清 用11α-孕酮-牛血清白蛋白(11α-P4-BSA)，免疫兔子所得，效价在1：104以上。
2.标准孕酮 用脱激素奶将标准孕酮稀释为一系列不同的浓度，如0.125,0.25，0.5，1，2，4，8，16 pg·?l-1。
3.酶标孕酮(即孕酮-辣根过氧化物酶结合物(P-HRP)) 由11α-孕酮-半琥珀酸(11α-P-HS)和辣根过氧化物酶(HRP)，通过共价键连结而成，稀释度大于1：106以上。
4.包被缓冲液(pH 9.6，0.05 mo1·L-1碳酸缓冲液)，用于稀释抗血清。
Na2CO3 1.59 g ； NaHCO3 2.93 g
NaN3 0.2 g ； 溶于1000 m1蒸馏水中。
5.测定缓冲液(pH7.0，0.1 mo1·L-1磷酸缓冲液，其中含0.87％NaCl和0.1％牛血清蛋白(BSA) 用于酶标抗原及样品的稀释。
Na2HP0·12H2O 21.85 g， NaCl 8.70 g
NaH2P04·2H 2O 6.08 g， BSA 1.00 g
溶于1000 m1蒸馏水中。
6.底物缓冲液(pH 5.4磷酸盐-柠檬酸缓冲液) 用于底物液的配制。
柠檬酸(C6H8O7·H2O) 0.47 g, Na2HP04·12H2O 2.00 g
溶于100 m1蒸馏水中。
7.底物 用于显色。
取10 mg·m1-1四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)或二甲亚矾液(DMSO) 0.2 ml，加入底物缓冲液至5 ml，使用前加50 ?l 0.6％的H202。
8.终止液(2 mol·L-1H2SO4溶液) 用于终止显色反应。
浓H2SO4 1份， 蒸馏水 9份。
9.冲洗液(含0.0 5％吐温(Tween)20，pH 7.4的磷酸缓冲液) 用于冲洗酶标板。
Na2HP04·12H20 2.9 g， KH2PO4 0.2 g
NaCl 8.0 g， KCl 0.2 g
Tween20 0.5 m1 溶于1000 ml蒸馏水中。
10.脱激素(孕酮)奶(发情牛奶通过由葡聚糖凝胶包被的活性炭吸附而得)
以5.0 g活性炭和0.5 g葡聚糖(G25)溶于250 m1不含BSA的测定缓冲液，磁力搅拌器搅拌30 min，成为用葡聚糖包被的活性炭(DCC)。取DCC一份，加等量奶样,3000 r·min-1离心10 min，取上清液即为脱激素奶。
[仪器与器材]
聚苯乙烯板(酶标板)，酶标测定仪，试剂瓶，微量加样器及塑料吸头(50 ?l，200 ?l，1000 ?l)，恒温水浴锅，水箱，磁力搅拌器。
[实验方法和步骤]
1.酶标板的预处理 新制的酶标板含有有机成分，使用前先用无水乙醇浸泡二小时以上，再用蒸馏水冲洗干净，37℃烘干或阴干。
2.制作孕酮抗血清稀释度曲线及选择孕酮抗血清工作浓度 将孕酮抗血清稀释成不同浓度，包被同一酶标板的不同孔眼后,测其光密度,其目的选择最适抗血清稀释工作浓度。随着抗血清浓度的下降，光密度也随之下降，一般初选光密度值为1.0左右时的稀释度为孕酮抗血清的工作浓度(图13.7-1)。
3.制作酶标孕酮稀释曲线及选择酶标孕酮工作浓度 以初选的抗血清稀释度包被酶标板，将酶标孕酮稀释成不同浓度，绘出酶标孕酮稀释曲线(见图13.7-2)，选择斜率最大并有一定光密度值的稀释度为工作浓度。
4.酶联免疫分析的操作步骤 （按表13.7-1程序进行）
(1)加孕酮抗体 酶标板第一纵列为空白,加包被液200μl作为参比孔，其他各列均加最适稀释度的孕酮抗血清200 u1稀释好的抗血清，置4℃冰箱过夜。
(2)冲洗未吸附的游离抗体 取出包被28 h以上的酶标板。吸去孔内液体，用冲洗缓冲液洗三次，吸干。
(3)加待检奶样或标准孕酮 在空白孔和0标准孔中加100 ?l去激素（孕酮）奶；其它标准孔中，每孔加100 ?l标准孕酮；样品孔中加5倍稀释的脱脂奶样100 ?l。每个样品至少有二个重复。
(4)加酶标孕酮 每孔加以所选最适稀释浓度的酶标孕酮100 u1。
(5)温育酶标准板置37℃恒温箱3 h。
(6)冲洗未结合的孕酮， 同(2)。
(7)显色反应 每孔加200 ?l新鲜配制的底物液，室温放置45～60 min，或37℃30 min，让其充分显色。
(8)终止反应 每孔加50 ?l 2 mol·L-1H2SO4,终止酶促反应。
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