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酶联免疫吸附技术（ELISA）的操作要点

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-08 　本站论坛

阳性判定值=NCX 0.05
标本 A 值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05 为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。
根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。
b.标本/阴性对照比值
在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（ S）和阴性对照（N）的A 值后，计算S/N 值。也有写作P/N 的，这里的P 不代表阳性(positive)，而是病人（pati ent）的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用S/N 表示。在早期的间接法ELISA 中，有些作者定出S/N 为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N 的阈值。更应注意的是，N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N<0.05
（或其他数值），则按0.05 计算，否则将出现假阳性结果。
（2）竞争法
在竞争法 ELISA 中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5 之间，此时反应最为敏感。竞争法 ELISA 不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P 和N 的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。
a. 阳性判定值法
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照 A 值，现举某种检测抗HBc 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc 的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc 含量为125±1 00u/ml。每次试验设2 个阳性对照和3 个阴性对照。测得A 值后，先计算阴性对照A 值的平均值（NC X ）和阳性对照A 值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验才有效。3 个阴性对照A 值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX 并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则
弃去，而以另2 个阴性对照重新计算×NCX；如有2 个阴性对照A 超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：
阴性判定值=0.4×NCX 0.6×PCX
标本A 值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。
b. 抑制率法
抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：
抑制率（%）= （阴性对照A 值-标本A 值）×100%/阴性对照A 值
一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。

7.2 定量测定
ELSIA 操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA ，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0 ，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S 形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。
测定小分子量物质常用竞争法（参见 2.2 ），其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相
关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。

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