Western印迹检测人血清IgG

6．把硝酸纤维素滤膜放入可加热封接的塑料袋中，根据滤膜面积以0.1 m1／cm²的量加入封闭液，尽可能排除里面的气泡，然后密封袋口，平放在平缓摇动的摇床上于室温温育1～2 h。

      7．将封闭过的硝酸纤维素滤膜放入另一个塑料袋中，用抗体稀释液800倍稀释抗体，按滤膜面积0.1 ml／cm²加入稀释抗体，密封袋口，平放在摇床上室温温育1 h。

      8．将滤膜转移至盛有漂洗液的浅托盘上，于室温平缓摇动，漂洗10min，重复3次。

      9．把经漂洗的硝酸纤维素滤膜移至一浅托盘上，按滤膜面积加入0.1 m1／cm²的底物溶液，细心观察反应过程，一旦蛋白带的颜色达到要求(约2min)，即取出滤膜，用去离子水略为漂洗，转移到盛有漂洗液的托盘中。记录条带位置，拍摄滤膜照片，留作永久实验记录。

    【注意事项】  

    1．电泳时不上样的上样孔要加等体积的样品缓冲液，防止样品扩散。   

    2．从裁剪滤纸到安装整个转移装置，都要戴手套操作，防止污染。

    3．滤纸、滤膜应与凝胶大小完全吻合，并要精确对齐，防止短路。   

    4．加入底物显色时，应仔细观察，蛋白主条带出现后应立即取出，终止反应，否则非特异性结合背景太高，影响实验效果。

    【器材】

电泳仪；垂直板电泳槽；转移装置；φ15cm培养皿 ；SearsSeal-A-Medal塑料袋；封口机；摇床；镊子；一次性手套等。

    【试剂】   

    1．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂见实验二十七。   

    2．稀释血清：取新鲜人血清50ul，加生理盐水0.95ml，加2×样品缓冲液，100℃煮沸3min，冷却。   

    3．转移缓冲液：2.9 g Gly+5.8 g Tris+0.379 g SDS+200 ml甲醇用水稀释至1L。

    4．丽春红S染液

    (1)贮存液：2.0 g丽春红S + 30 g三氯醋酸 + 30 g磺基水杨酸，加水至100 ml。

    (2)使用液：使用前取1份贮存液加9份去离子水，混匀使用后即废弃。

    5．Western blotting缓冲液A液：9 g NaCl + 12.1 g Tris，加水500ml溶解，加0.1 mol／L

  HCl(标定过)403 ml，调节pH至7.5，定容至1000ml。

    6．封闭液： l g牛血清白蛋白 + 50μl Tween-20，用A液定容至100 ml。

    7．稀释抗体：取20μl HRP-羊抗人IgG抗体，加封闭液16 ml，混匀。

    8．漂洗液：400 ml A液 + 1ml Tween-20，混匀。

    9．底物溶液   

    (1)30 mg二氨基联苯胺溶于30ml水，加A液5 ml，过滤定容至50 ml，临用前配，放棕色瓶中。

    (2)0.3％CoCl₂：称取CoCl₂ 30 mg溶于10 ml水。

临用时取(1)液9ml (2)液1 ml，加10 ul 30％ H₂O₂，混匀。